Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

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Tesis Doctoral real (RT-‐PCR). Tras la obtención de los datos crudos de expresión de todos los miRNAs, se procedió a la elaboración de una lista de miRNAs desregulados/alterados significativamente. Dicha lista fue obtenida mediante la comparación de la expresión de los miRNAs de cada alteración citogenética en relación a las células plasmáticas sanas, utilizando para ello el algoritmo SAM con un punto de corte por p-‐valor corregido: FDR < 0.001. De este modo, se identificaron 11, 7, 8, 37 and 18 miRNAs para los pacientes con t(4;14), t(11;14), t(14;16), delRB y FISH normal respectivamente (ver tabla 2.3). El trabajo principal realizado en la presente Tesis Doctoral con los datos de MM, se centra en aplicar un modelo predictivo para estimar el nivel de asociación entre las distintas categorías de pacientes y el conjunto de miRNAs alterados, para lo cual se utilizó el algoritmo Global Test (Goeman et al., 2004). Este algoritmo permite predecir la influencia de uno o varios factores predefinidos –que en este caso son un conjunto de miRNAs con sus perfiles de expresión– sobre una variable de respuesta o de salida (outcome) que es testada –que en este caso son los subtipos de enfermedad MM definidos–. La hipótesis nula correspondería al hecho de que el perfil de expresión del conjunto de factores testado no está asociado a la variable de respuesta. En el caso de MM analizamos la expresión de los miRNAs para identificar cuales son los que mejor marcan o predicen las distintas alteraciones del cariotipo usadas como respuesta. Este algoritmo se utilizó en su versión para R con el paquete llamado globaltest (Goeman and Oosting, 2009) incluido en Bioconductor. 2.3. Resultados 2.3.1. Análisis de muestras de Leucemia Linfocítica Crónica El análisis de expresión diferencial aplicado a las muestras del grupo de estudio de CLL 13q-‐H contra las muestras CLL 13q-‐L devolvió un total de 3.450 genes significativos de los cuales 1.244 estaban sobre-‐expresados y 2.206 reprimidos en 13q-‐H. Esta diferencia importante indica que muestras que presentan la misma enfermedad con una misma alteración citogenética tienen un patrón de expresión diferente atendiendo al porcentaje de blastos encontrados con dicha pérdida de 13q. Esto significa que las categorías patológicas definidas por los datos clínicos (de mejor o peor pronóstico) presentan también diferencias a nivel biológico transcriptómico, lo que confirma la principal hipótesis de trabajo. Una posterior comprobación por RT-‐PCR validó varios de los genes encontrados como alterados: GAS7, E2F1 y FCRL2. Otras de las hipótesis de trabajo de este estudio es que los grupos de peor pronóstico, como son CLL 13q-‐H y del(17p/11q), comparten un perfil de expresión más cercano que las de mejor pronóstico, CLL 13q-‐L y CLL-‐nk. La utilización de un método de agrupamiento no supervisado utilizando todos los genes detectables por los microarrays no fue de utilidad debido a que la gran variabilidad entre pacientes por muchos factores posibles –ocultos o no definidos– hace imposible el agrupamiento entre las muestras del mismo tipo según las categorías dadas (datos no presentados). De esta manera, se realizó un análisis semi-‐supervisado calculando la distancia entre las distintas categorías utilizando los 3450 genes significativos que diferencian las CLLs 13q-‐H de las 13q-‐L. La figura 2.1 muestra un heatmap de este análisis de clasificación semi-‐supervisado presentando los correspondientes agrupamientos jerárquicos a nivel de genes y a nivel de muestras. Las distancias en ambos casos se miden utilizando la correlación de Pearson (d=1-‐cor) y el tipo "complete" para calcular la disimilaridad con un método 52
Capítulo 2 aglomerativo. El propósito de este test no fue medir las diferencias específicas entre 13q-‐H y 13q-‐L, ya que utilizando únicamente los genes con expresión diferencial significativa entre estas categorías ya observamos una gran diferencia. El propósito era determinar cuál de los dos grupos es más parecido al grupo del(17p/11q) de mal pronóstico. Es manifiesto en el análisis que las categorías 13q-‐H (rojo) y del(17p/11q) (magenta) quedan más cercanas entre sí que 13p-‐B (azul), lo cual puede apreciarse en la primera división del dendrograma. Esto confirma de nuevo que las semejanzas y diferencias en las variables clínicas (grupos de peor pronóstico) de los distintos subtipos de CLL, se reflejan en sus características transcriptómicas. Figura 2.1. Heatmap de las muestras de CLL 13q-‐H (n=7), 13q-‐L (n=6) y del(17p/11q) (n=6) etiquetadas en rojo, azul y magenta respectivamente. Se utilizaron los 3450 genes encontrados en el test de expresión diferencial entre 13q-‐H y 13q-‐L. La figura muestra dos grupos principales: uno con las muestras 13q-‐L; otro con las muestras 13q-‐H y del(17p/11q). El resultado es consistente con datos clínicos de prognosis que es diferente entre ambos grupos. Para comprobar si las muestras del grupo de validación (32 pacientes diferentes, ver tabla 2.1) replicaban el comportamiento de las muestras del grupo de estudio (27 muestras) se obtuvo para este grupo un conjunto más fiable de genes marcadores reduciendo el punto de corte del contraste de CLLs 13q-‐H contra 13q-‐L (de FDR < 0,05 a < 0,01), lo cual proporcionó 1030 genes. A continuación, utilizando el algoritmo Global Test, se analizó la influencia de este conjunto de genes para poder discernir las dos categorías A y B en el grupo de validación (que incluye 7 muestras de CLL 13q-‐H y 11 muestras de CLL 13q-‐L). Este análisis dio un p-‐valor significativo de 0,0935 que confirma que los genes encontrados en el grupo de estudio sirven también para distinguir entre las categorías 13q-‐H y 13q-‐L en el grupo de validación para la mayoría de las 53
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