Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

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Tesis Doctoral exacto del número de exones pertenecientes a cada isoforma. Esta es una clara limitación debido a que el número y definición de los transcritos conocidos es muy variable entre distintas versiones de las bases de datos de referencia (ver apartado 1.3.6) y a que a nivel global del genoma esta información es bastante parcial para muchos loci génicos. Además, el rápido aumento en el número de transcritos identificados en las nuevas entregas de las bases de datos biológicas (p. ej. Ensembl) aumenta notablemente la ambigüedad de resultados basados en estructuras obsoletas complicando su interpretación. Por todo ello, no presuponer unas isoformas concretas y apuntar a exones y genes directamente en lugar de transcritos es una solución más acertada que se basa en una evidencia biológica más sólida y en una información más estable. Respecto a la implementación de las diferentes estrategias, predominan los desarrollos y métodos hechos en R (como es el caso de FIRMA, COSIE y ARH). Sin embargo ARH no proporciona un programa completo en R, ya que es necesario descargar y utilizar un código escrito en C++, Python, Perl y R llamado "MAT background correction" (Kapur et al., 2007). Rasche y Herwing utilizan este programa para corregir el background y normalizar las muestras, pero su falta de integración total con R y la necesidad de comunicar los distintos pasos del análisis mediante ficheros de texto hacen de ARH una herramienta de uso tedioso y poco eficaz. Además el usuario debe proporcionar por su cuenta los distintos ficheros de anotación, como el nombre de los identificadores de los exones y a qué genes pertenecen. Nuestra propuesta para un nuevo algoritmo de análisis de splicing se centra en estudiar la relación entre la expresión global del gen y la expresión individual de cada exón, como en la mayoría de algoritmos revisados anteriormente. La estrategia novedosa que planteamos es estimar la expresión de cada exón en función de los valores de expresión de los otros exones del gen utilizando modelos lineales y calcular también su desvío sobre la expresión global esperada, asignándole un valor de probabilidad p. 3.2.3 El efecto sonda y su papel en los microarrays de exones Como es sabido, no todas las sondas de oligos (de 25 nucleótidos) de un microarray reflejan la cantidad de su RNA diana de la misma manera. Análisis de series de arrays hibridadas con concentraciones crecientes de RNA (llamados experimentos de spiked-‐in con arrays) han revelado características variables en las sondas respecto a la señal de hibridación que muestran ante la misma cantidad de RNA y la señal de aumento de expresión ante un mismo aumento de concentración de RNA (Irizarry et al., 2003b). En la figura 3.1, Irizarry et al. muestran 20 sondas de control (perfect match del probeset AFFX-‐BioB-‐5) del modelo del microarray Affymetrix U95A. Estas sondas de control no mapean sobre un mRNA humano, sino que tienen como objetivo servir de medida de calidad hibridando genes de E. coli que se añaden como controles en concentración conocida junto a la muestra a estudiar (siguiendo el protocolo experimental de Affymetrix). Este RNA de E. coli, al ser añadido en concentraciones conocidas crecientes, sirve para estudiar el comportamiento de las sondas que detectan su expresión. En la figura 3.1 se ve la tendencia general de todas las sondas a aumentar su intensidad de manera dependiente de la concentración de RNA, sin embargo, no todas se sitúan al mismo nivel ni tienen la misma pendiente. Esto es lo que se ha denominado el "efecto sonda", e implica que la misma sonda es comparable entre distintas muestras, pero no se pueden comparar distintas sondas de la misma muestra de forma directa. Por extensión, este efecto se traslada igual cuando se consideran grupos o conjuntos de sondas (i.e. probesets). 64
Capítulo 3 Figura 3.1. El nivel de intensidad y respuesta ante concentraciones crecientes de RNA no es el mismo para cada una de las 20 sondas pertenecientes al grupo de control AFFX-‐BioB-‐5 (Irizarry et al., 2003b). Las causas de estas diferencias de reactividad entre sondas no son bien conocidas. Una de ellas puede ser el distinto porcentaje de guanina, citosina (%GC) entre distintas sondas. La figura 3.2 muestra un diagrama de dispersión en el que cada punto representa una sonda del array Human Exon 1.0, ubicadas espacialmente en función de su mediana (eje x) y su rango (eje y) de expresión en un set de datos de 33 muestras (11 tejidos) publicado por Affymetrix. Figura 3.2. Sondas del array Human Exon 1.0 situadas en función de su mediana y rango de expresión según el set de 33 microarrays publicado por Affymetrix (11 tejidos x 3 réplicas). Las sondas en rojo y en azul se corresponden con alto y bajo %GC respectivamente. Ambos grupos muestran características diferentes. 65
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