Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

Tesis Doctoral
real (RT-­‐PCR). Tras la obtención de los datos crudos de expresión de todos los miRNAs, se
procedió a la elaboración de una lista de miRNAs desregulados/alterados significativamente.
Dicha lista fue obtenida mediante la comparación de la expresión de los miRNAs de cada
alteración citogenética en relación a las células plasmáticas sanas, utilizando para ello el
algoritmo SAM con un punto de corte por p-­‐valor corregido: FDR < 0.001. De este modo, se
identificaron 11, 7, 8, 37 and 18 miRNAs para los pacientes con t(4;14), t(11;14), t(14;16),
delRB y FISH normal respectivamente (ver tabla 2.3).
El trabajo principal realizado en la presente Tesis Doctoral con los datos de MM, se centra en
aplicar un modelo predictivo para estimar el nivel de asociación entre las distintas categorías
de pacientes y el conjunto de miRNAs alterados, para lo cual se utilizó el algoritmo Global Test
(Goeman et al., 2004). Este algoritmo permite predecir la influencia de uno o varios factores
predefinidos –que en este caso son un conjunto de miRNAs con sus perfiles de expresión–
sobre una variable de respuesta o de salida (outcome) que es testada –que en este caso son los
subtipos de enfermedad MM definidos–. La hipótesis nula correspondería al hecho de que el
perfil de expresión del conjunto de factores testado no está asociado a la variable de
respuesta. En el caso de MM analizamos la expresión de los miRNAs para identificar cuales son
los que mejor marcan o predicen las distintas alteraciones del cariotipo usadas como
respuesta. Este algoritmo se utilizó en su versión para R con el paquete llamado globaltest
(Goeman and Oosting, 2009) incluido en Bioconductor.
2.3. Resultados
2.3.1. Análisis de muestras de Leucemia Linfocítica Crónica
El análisis de expresión diferencial aplicado a las muestras del grupo de estudio de CLL 13q-­‐H
contra las muestras CLL 13q-­‐L devolvió un total de 3.450 genes significativos de los cuales
1.244 estaban sobre-­‐expresados y 2.206 reprimidos en 13q-­‐H. Esta diferencia importante
indica que muestras que presentan la misma enfermedad con una misma alteración
citogenética tienen un patrón de expresión diferente atendiendo al porcentaje de blastos
encontrados con dicha pérdida de 13q. Esto significa que las categorías patológicas definidas
por los datos clínicos (de mejor o peor pronóstico) presentan también diferencias a nivel
biológico transcriptómico, lo que confirma la principal hipótesis de trabajo. Una posterior
comprobación por RT-­‐PCR validó varios de los genes encontrados como alterados: GAS7, E2F1
y FCRL2.
Otras de las hipótesis de trabajo de este estudio es que los grupos de peor pronóstico, como
son CLL 13q-­‐H y del(17p/11q), comparten un perfil de expresión más cercano que las de mejor
pronóstico, CLL 13q-­‐L y CLL-­‐nk. La utilización de un método de agrupamiento no supervisado
utilizando todos los genes detectables por los microarrays no fue de utilidad debido a que la
gran variabilidad entre pacientes por muchos factores posibles –ocultos o no definidos– hace
imposible el agrupamiento entre las muestras del mismo tipo según las categorías dadas
(datos no presentados). De esta manera, se realizó un análisis semi-­‐supervisado calculando la
distancia entre las distintas categorías utilizando los 3450 genes significativos que diferencian
las CLLs 13q-­‐H de las 13q-­‐L. La figura 2.1 muestra un heatmap de este análisis de clasificación
semi-­‐supervisado presentando los correspondientes agrupamientos jerárquicos a nivel de
genes y a nivel de muestras. Las distancias en ambos casos se miden utilizando la correlación
de Pearson (d=1-­‐cor) y el tipo "complete" para calcular la disimilaridad con un método
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