Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

Tesis Doctoral
exacto del número de exones pertenecientes a cada isoforma. Esta es una clara limitación
debido a que el número y definición de los transcritos conocidos es muy variable entre
distintas versiones de las bases de datos de referencia (ver apartado 1.3.6) y a que a nivel
global del genoma esta información es bastante parcial para muchos loci génicos. Además, el
rápido aumento en el número de transcritos identificados en las nuevas entregas de las bases
de datos biológicas (p. ej. Ensembl) aumenta notablemente la ambigüedad de resultados
basados en estructuras obsoletas complicando su interpretación. Por todo ello, no presuponer
unas isoformas concretas y apuntar a exones y genes directamente en lugar de transcritos es
una solución más acertada que se basa en una evidencia biológica más sólida y en una
información más estable.
Respecto a la implementación de las diferentes estrategias, predominan los desarrollos y
métodos hechos en R (como es el caso de FIRMA, COSIE y ARH). Sin embargo ARH no
proporciona un programa completo en R, ya que es necesario descargar y utilizar un código
escrito en C++, Python, Perl y R llamado "MAT background correction" (Kapur et al., 2007).
Rasche y Herwing utilizan este programa para corregir el background y normalizar las
muestras, pero su falta de integración total con R y la necesidad de comunicar los distintos
pasos del análisis mediante ficheros de texto hacen de ARH una herramienta de uso tedioso y
poco eficaz. Además el usuario debe proporcionar por su cuenta los distintos ficheros de
anotación, como el nombre de los identificadores de los exones y a qué genes pertenecen.
Nuestra propuesta para un nuevo algoritmo de análisis de splicing se centra en estudiar la
relación entre la expresión global del gen y la expresión individual de cada exón, como en la
mayoría de algoritmos revisados anteriormente. La estrategia novedosa que planteamos es
estimar la expresión de cada exón en función de los valores de expresión de los otros exones
del gen utilizando modelos lineales y calcular también su desvío sobre la expresión global
esperada, asignándole un valor de probabilidad p.
3.2.3 El efecto sonda y su papel en los microarrays de exones
Como es sabido, no todas las sondas de oligos (de 25 nucleótidos) de un microarray reflejan la
cantidad de su RNA diana de la misma manera. Análisis de series de arrays hibridadas con
concentraciones crecientes de RNA (llamados experimentos de spiked-­‐in con arrays) han
revelado características variables en las sondas respecto a la señal de hibridación que
muestran ante la misma cantidad de RNA y la señal de aumento de expresión ante un mismo
aumento de concentración de RNA (Irizarry et al., 2003b). En la figura 3.1, Irizarry et al.
muestran 20 sondas de control (perfect match del probeset AFFX-­‐BioB-­‐5) del modelo del
microarray Affymetrix U95A.
Estas sondas de control no mapean sobre un mRNA humano, sino que tienen como objetivo
servir de medida de calidad hibridando genes de E. coli que se añaden como controles en
concentración conocida junto a la muestra a estudiar (siguiendo el protocolo experimental de
Affymetrix). Este RNA de E. coli, al ser añadido en concentraciones conocidas crecientes, sirve
para estudiar el comportamiento de las sondas que detectan su expresión. En la figura 3.1 se
ve la tendencia general de todas las sondas a aumentar su intensidad de manera dependiente
de la concentración de RNA, sin embargo, no todas se sitúan al mismo nivel ni tienen la misma
pendiente. Esto es lo que se ha denominado el "efecto sonda", e implica que la misma sonda
es comparable entre distintas muestras, pero no se pueden comparar distintas sondas de la
misma muestra de forma directa. Por extensión, este efecto se traslada igual cuando se
consideran grupos o conjuntos de sondas (i.e. probesets).
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