Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

Capítulo 2
procedentes del Hospital Clínico Universitario de Salamanca fueron procesadas e hibridadas en
la plataforma de microarrays por el grupo de investigación del laboratorio 12 del Centro de
Investigación del Cáncer de Salamanca. Estas muestras incluyen un total de 102 perfiles de
expresión que contienen un grupo de estudio, un grupo de validación y un grupo de muestras
sanas. El grupo de estudio lo componen 70 muestras procedentes de células mononucleares
de sangre periférica (PBMCs) aisladas por gradiente de Ficoll. El grupo de validación,
compuesto de 32 muestras, fue obtenido a partir de células CD19 positivas (linfocitos B,
CD19+) purificadas al 98% mediante la técnica de clasificación de células activadas
magnéticamente (MACS). Finalmente el grupo de control está formado por 5 muestras
procedentes de donantes sanos también purificadas al 98% mediante MACS.
La clasificación de estas muestras se hizo en función de sus aberraciones cromosómicas. Los
casos 13q-­‐ se dividieron en 13q-­‐H (A de porcentaje Alto) cuando el porcentaje de células
presentando la alteración 13q-­‐ era superior al 80%, y 13q-­‐L (B de porcentaje Bajo) en el caso
contrario. Los casos de pérdida en 17p y/o de 11q –del(17p/11q)– fueron agrupados en la
misma categoría por tener características clínicas similares. También se incluyeron muestras
de CLL que, mediante la técnica de hibridación con fluorescencia in situ (FISH), mostraron un
cariotipo normal (denominadas CLL-­‐nk ó CLL 13q-­‐N). La última categoría la constituyen las
muestras de linfocito B sanos como grupo control.
Al ser un estudio amplio y planteado en varias fases, la mayoría de las muestras del grupo de
estudio fueron utilizadas para ser analizadas con PCR cuantitativa de genes y de miRNAs,
mientras que otra parte (27 muestras) fueron hibridadas con el chip Human Exon 1.0 para
obtener la firma de expresión génica global. El grupo de validación fue íntegramente analizado
con Human Exon 1.0 (ver tabla 2.1). El trabajo de detección de biomarcadores se centró
únicamente en el análisis de las muestras hibridadas con microarrays de exones para los que
se tenía la señal de expresión global.
Tipos de muestras
Grupo de
estudio
(PBMC)
Subgrupo de estudio:
muestras hibridadas con HEx1
(células mononucleares PBMC)
Grupo de validación:
hibridadas con HEx1
(células CD19+)
CLL 13q-­‐H 25 7 7
CLL 13q-­‐L 27 6 11
CLL-­‐nk (cariotipo normal) 8 8 9
CLL del(17p/11q) 10 6 –
Células CD19+ sanas (control) 0 – 5
TOTAL 70 27 (incluidas en el grupo de 70) 32
Tabla 2.1. Número de muestras por cada subtipo de CLL para el grupo de estudio y el grupo de validación.
Dado el distinto contenido celular (muestras PBMCs y muestras CD19+), dependiente del
método de purificación utilizado, los microarrays hibridados con las muestras del grupo de
estudio y los hibridados con la muestras del grupo de validación fueron analizados por
separado. En ambos grupos se utilizó el algoritmo RMA para la normalización y cálculo de señal
en combinación con el paquete CDF GeneMapper de GATExplorer en su versión para Human
Exon 1.0 (Ensembl v53 – NCBI36). La utilización de la herramienta descrita en el capítulo 1 en
lugar de los probesets originales de Affymetrix conlleva todas las ventajas descritas también en
dicho capítulo.
Para encontrar genes que marcadores de las distintas categorías anteriormente especificadas
se utilizó el algoritmo SAM, proporcionando genes con una diferencia de expresión
significativa, situando el punto de corte del p-­‐valor corregido en FDR < 0,05. La capacidad de
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