Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

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Tesis Doctoral Human Exon 1.0. La lógica del algoritmo se implementó en un paquete llamado ESLiM que incluye las siguientes funciones: 74 • doLinearModel: Realiza el cálculo de residuales a partir de las matrices de expresión a nivel de genes (medidos con la estrategia "total" de ESLiMt o por la estrategia "core" de ESLiMc ya explicadas) y a nivel de exones. Para este cálculo también se necesita el fichero de anotación de exones presente en GATExplorer donde se relaciona cada identificador de exón (ENSE) con el identificador del gen (ENSG). • removeRedundantExons: Elimina los exones de Ensembl que son redundantes, ya que –pese a ser casi solapantes y estar localizados en la misma región cromosómica y locus génico– tienen identificadores (ENSE ids) diferentes por variar su longitud en una pocas bases (bp) o tener distintos puntos de inicio o final UTR. Para eliminar esta redundancia, todos los identificadores de exones mapeados por el mismo conjunto de sondas de un microarray son agrupados en uno solo, tomándose como identificador único el primero (siguiendo el orden alfabético). Esta función elimina así muchos resultados que son totalmente redundantes (debido al problema de los ids descrito) que analizan exactamente la misma región exónica codificante. Esta función toma como entrada el listado generado por la función anterior: doLinearModel. • geneOriented: Agrupa los distintos exones significativos colapsándolos en genes. Estos exones significativos han sido identificados previamente a partir de los residuales obtenidos por la función doLinearModel y tras el paso de eliminación de redundancias. La función toma como entrada los identificadores de exones, sus p-‐valores y el fichero de anotación de exones de GATExplorer. Como salida esta función proporciona el porcentaje de exones alterados para cada gen respecto del total de exones detectables por el microarray, haciendo distinción entre exones codificantes y exones no codificantes de proteína. Además proporciona 2 valores de probabilidad: el p-‐valor más bajo de todos sus exones y la mediana de todos ellos. Las listas procedentes de análisis de expresión diferencial a nivel de genes suelen proporcionar varios cientos o miles de entradas. A pesar de existir herramientas para realizar interpretaciones automáticas de estos listados, a menudo puede ser demasiada información para el investigador. Este problema se agrava con el manejo de listas de exones, que multiplica en más de 10 el tamaño de las listas de genes (ver introducción, tabla 1). La orientación a genes que proporciona el paquete ESLiM en su salida final, permite una reducción del número de resultados significativos ya que apunta directamente a genes específicos como los mejores candidatos a sufrir splicing. Los resultados amplios –muchas veces masivos– obtenidos exón a exón también son proporcionados por el algoritmo, pero son puestos en un segundo plano. En todo caso la salida puede ser reordenada por el usuario por significación acorde a los distintos parámetros proporcionados por el algoritmo. 3.3.2 Comparativa de ESLiMt y ESLiMc con otros algoritmos para la búsqueda de splicing previamente publicados La eficiencia de cada algoritmo fue medida utilizando como set de datos de comparación el set de Affymetrix de microarrays de exones de 11 tejidos humanos –con tres réplicas cada uno– combinado con los datos de splicing validados respecto a una serie de genes humanos en distintos tejidos (Wang et al., 2008). Esta combinación suministró un conjunto final de 6 tejidos (ver apartado 3.2.1). Estos 6 tejidos fueron comparados 2 a 2 por cada uno de los 5
Capítulo 3 métodos analizados produciendo un total de 15 contrastes. Los algoritmos ESLiMc, ESLiMt, FIRMA y COSIE devuelven un valor por muestra y exón, por lo que solamente hizo falta ejecutar una vez cada uno de ellos utilizando posteriormente el paquete limma (Smyth et al., 2012) para realizar el ranking de exones por cada par de tejidos. ARH devuelve directamente un valor de significación por gen (ARH values), por lo que debió ejecutarse 15 veces, uno por cada contraste. La cobertura sobre los genes con splicing conocido validado experimentalmente (Wang et al., 2008) por cada par de tejidos es muy similar en todos los algoritmos, exceptuando ESLiMt que, debido a lo restrictivo del método de selección de sondas, solamente tiene la capacidad de medir aproximadamente la mitad de los genes (ver tabla 3.3). La comparación entre hígado y músculo (LIV-‐MUS) no pudo medirse con ESLiMt ya que ninguno de los 2 genes validados en este contraste pudo mapearse según en el criterio de esta versión del algoritmo. ESLiMc ESLiMt FIRMA ARH COSIE Nº total de genes con splicing validado BRE-‐CER 71 32 75 75 73 75 BRE-‐HEA 10 5 11 11 9 11 BRE-‐LIV 4 2 5 5 5 5 BRE-‐MUS 8 4 8 8 8 8 BRE-‐TES 16 9 16 16 15 16 CER-‐HEA 21 15 22 22 21 22 CER-‐LIV 12 5 12 12 12 12 CER-‐MUS 37 19 38 38 38 38 CER-‐TES 48 22 52 52 51 52 HEA-‐LIV 2 2 2 2 2 2 HEA-‐MUS 12 5 13 13 13 13 HEA-‐TES 7 5 7 7 7 7 LIV-‐MUS 2 0 2 2 2 2 LIV-‐TES 5 4 5 4 4 5 MUS-‐TES 14 4 14 14 14 14 Nº de genes validados detectados 269 133 282 281 274 282 Nº total de genes 37388 32039 37567 39316 21504 Nº de genes codificantes de proteína 19346 14351 20812 19871 17926 Tabla 3.3. Número de genes validados por cada algoritmo y par de tejidos. Los números de los nuevos métodos presentados en este trabajo (ESLiMc y ESLiMt) figuran en negrita. ESLiMt es el método que menor cobertura presenta debido a una selección muy restrictiva de sondas para calcular la expresión del gen. Para comparar la precisión de cada uno de los métodos se utilizaron curvas ROC (Receiver Operating Characteristic) para cada uno de los pares de tejido comparados. Las curvas ROC miden y comparan de modo gráfico la "tasa de verdaderos positivos" (TPR) o "sensibilidad" (VP/(VP+FN)) frente a la "tasa de falsos positivos" (TFP) o "1-‐especificidad" (FP/(FP+VN)) sobre un clasificador binario (Draghici, 2003). La comparación entre dos curvas se mide mediante el área bajo la curva (AUC), que varía entre 0.5 en caso de total aleatoriedad y 1.0 en caso de clasificación perfecta. Este análisis se realizó mediante el uso del paquete de R llamado ROCR (Sing et al., 2005). La figura 3.10 presenta en 15 paneles consecutivos las curvas ROC correspondientes a los contrastes de los 15 pares de tejidos comparados, incluyendo cada panel la curva correspondiente a los 5 métodos: ESLiMc, ESLiMt, FIRMA, ARH y COSIE. 75
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