Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

Tesis Doctoral
los genes encontrados para diferenciar las distintas categorías se comprobó mediante
métodos de agrupamiento jerárquicos representados como heatmaps. Para realizar un análisis
más detallado de la firma génica significativa y ver si esta permitía discernir y separar bien las
distintas categorías en base a sus semejanzas y diferencias de expresión, se utilizó un análisis
de componentes principales (PCA). Basados en el resultado de este análisis se realiza una
representación tridimensional de las muestras sobre los valores de las tres primeras
componentes proporcionadas por el PCA a partir de la matriz de expresión normalizada. Dicha
matriz de expresión fue filtrada previamente eliminando el 25% de los genes que menos
variaban su expresión (calculado con el rango intercuartil, IQR) para permitir reducir ruido al
eliminar genes no informativos. A continuación se calcula la mediana de la expresión de cada
gen por cada una de las categorías y se introducen estos valores en la siguiente fórmula:
50
Y ij = X ij − median(ik)
sd(ik) + β
+ median(ik)
Esta fórmula fue diseñada para calcular los valores de expresión por gen y muestra
considerando su variabilidad dentro de su categoría; siendo Yij la matriz de expresión utilizada
para el PCA, Xij la matriz de expresión original, i el gen, j la muestra, k la categoría y β una
constante positiva con valor 2, añadida al denominador para asegurar que la varianza de Yij es
independiente de la desviación estándar de los genes. Esta fórmula representa una estrategia
eficaz para calcular la dispersión de las muestras, réplicas biológicas, basada en su mediana en
cada categoría. De esta forma se pueden representar las diferencias entre categorías
atenuando la variación entre muestras individuales. El cálculo del PCA se realizó mediante la
función prcomp del paquete stats (R_Development_Core_Team, 2010) y la representación
visual del mismo mediante el paquete rgl (Alder and Murdoch, 2011), ambos de R.
Por último, para el grupo de validación se realizó una selección de las muestras de CLL que
marcan de modo más coherente las categorías CLL 13q-­‐H y CLL 13q-­‐L aplicando un algoritmo
de análisis de respuesta (outcome) denominado Global Test que se describe en el siguiente
apartado.
2.2.2. Muestras de Mieloma Múltiple y métodos aplicados
Los análisis sobre MM se realizan sobre un conjunto de muestras de médula ósea tomadas de
60 pacientes y de 5 controles sanos (obtenidas por el grupo de Hematología del Hospital
Clínico Universitario de Salamanca).
Alteraciones citogenéticas Número de muestras
MM t(4;14) 17
MM t(11;14) 11
MM t(14;16) 4
MM delRB (con deleción de RB) 14
MM delRBp53 (deleción RB y TP53) 1
MM con FISH normal 13
Células plasmáticas sanas (control) 5
TOTAL 65
Tabla 2.2. Características citogenéticas de 60 pacientes diagnosticados con
MM incluyendo 5 muestras de células sanas como controles.
En estas muestras se aislaron las células plasmáticas utilizando el marcador CD138+ mediante