Alberto Risueño Pérez - Gredos - Universidad de Salamanca

Capítulo 1
exhaustivo en este ámbito, proporcionando una redefinición de los arrays de Affymetrix para
varias especies. Nuestro grupo de investigación del Centro del Cáncer inició los trabajos de re-­‐
mapeo de sondas de microarrays también en torno a 2005, aunque nos propusimos
profundizar más en el problema del análisis de la expresión génica global estudiando a fondo
los algoritmos de análisis y abordando de modo más integrado el sentido y las ventajas que
tiene re-­‐mapear las sondas de los microarrays. Por ello, emprendimos un trabajo ambicioso
que incluye no sólo la re-­‐anotación de sondas y el re-­‐mapeo a genes conocidos, sino también
la búsqueda de otras entidades transcriptómicas a las que los miles de sondas no asignadas a
genes codificantes se pudieran reasignar. Por ello, se realizó el re-­‐mapeo a la base de datos de
ncRNAs (ver figura 1.8) que es genuino de nuestro estudio (como se indica también en la tabla
1.9). Finalmente, GATExplorer también incluye la herramienta de visualización de sondas
integrada en una plataforma web, navegador genómico transcriptómico, que no se ha
desarrollado en ninguno de los otros trabajos publicados antes y que proporciona una gran
ayuda para la mejor comprensión de resultados de estudios de expresión.
Tras el desarrollo del algoritmo de remapeo incluido en GATExplorer realizamos un análisis
comparativo con el mapeo original de Affymetrix combinando distintos algoritmos de
normalización, utilizando una colección de microarrays que compara la expresión global de
ratones knock-­‐out (a los cuales les falta un gen concreto) con la expresión en los ratones
normales (wild-­‐type). Este análisis busca demostrar con un ejemplo práctico la eficiencia de
aplicar un re-­‐mapeo actualizado en base a conocimiento actual de los genes para cualquier
análisis de expresión dado.
En la tabla 1.10 se presentan los resultados del estudio comparativo para identificar expresión
diferencial en varios sets de microarrays para los que se utilizan tanto la anotación original de
Affymetrix (probesets) como con el remapeo nuevo de GATExplorer. Los análisis se han hecho
usando 3 algoritmos de normalización: MAS5.0 (Hubbell et al., 2002; Liu et al., 2002), FARMS
(Hochreiter et al., 2006) y RMA (Irizarry et al., 2003a). Los tres algoritmos se han probado
utilizando la anotación original de Affymetrix; y además el algoritmo RMA es el que se ha
utilizado para obtener la señal de expresión con el re-­‐mapeo de GATExplorer. El uso de ambos
mapeos se realiza mediante Chip Definition Files (CDFs) utilizando R y los paquetes de
BioConductor (Gentleman et al., 2004; Smyth, 2005). Como algoritmo de detección de
expresión diferencial utilizamos SAM (Tusher et al., 2001). Las muestras comparadas son una
colección de 5 series de microarrays de 6 muestras cada una. Cada set incluye 3 réplicas
biológicas de ratones knock-­‐out (KO) para un gen específico que es comparado con las 3
réplicas biológicas correspondientes con el wild-­‐type (WT). Estos 5 genes son: APOE-­‐/-­‐, IRS2-­‐/-­‐,
NRAS-­‐/-­‐, SCD1-­‐/-­‐ y ENG+/-­‐ (ver tabla 1.10). El objetivo de estas comparaciones es identificar la
posición del gen no presente (i.e. eliminado por knock-­‐out) en el ranking de genes cuya
expresión está alterada entre ambos grupos de ratones. En condiciones ideales, el gen que no
está presente en los ratones KO debería ser el que experimentase la mayor diferencia,
mostrando la infra-­‐expresión máxima comparada con los ratones WT. En esta comparación se
trata de medir cómo afectan los métodos y el re-­‐mapeo al resultado de la expresión diferencial
y qué análisis sitúa al gen KO en una posición más alta en el ranking. Los resultados indican que
el uso del mapeo de GATExplorer funciona en general mejor que el uso de probesets originales
de Affymetrix, ya que en todos los casos el gen KO se encuentra entre los primeros de la lista
de genes infra-­‐expresados. Cada uno de los genes testados tiene funciones diferentes, están
implicados en distintos mecanismos moleculares y tienen distintos genes asociados que
pueden verse afectados por el KO. Por lo tanto, no se puede asumir que el gen KO debe ser
siempre identificado como el más reprimido, pero sí debe ser uno de los más reprimidos y, sin
duda, debe ser estadísticamente significativo. No obstante, podemos encontrar diferencias
significativas entre los 4 métodos utilizados, diferencias que no pueden deberse a la biología –
que es idéntica por usarse las mismas muestras en la comparación– sino a los diferentes
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