Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

Des inoculums ont été préparés à partir de 0,2g de larves de C. gigas saines ou
vi rosées, broyées dans 5 ml de tampon phosphate (PBS) et ultrafiltrées stérilement sur
membrane de porosité 0,2 J.lm (Le Deuff et al., 1994). 500 J.ll de ces broyats purs ou dilués en
PBS ont été inoculés à des tapis cellulaires (25 cm2) des différentes lignées. Des cultures
témoins ont été inoculées par 500 J.ll de PBS. Après un contact d'une heure, 5 ml de milieu
supplémenté par 2% de SVF ont été additionnés à chaque fiole. L'incubation des cultures a été
poursuivie en parallèle à 18, 24 et 28 oc.
L'observation quotidienne des cultures au microscope inversé à contraste de phase
révèle, 24 heures post infection, une vacuolisation importante des cellules dans les fioles
inoculées avec les broyats non dilués de larves saines et virosées (Résultat non montré). Cet
effet toxique, plus ou moins prononcé selon les lignées cellulaires, disparaît lorsque les
inoculurns sont dilués au 1/10.
Un effet cytopathogène prononcé et spécifique, pour les échantillons virosés, a pu être
observé à partir de 48 heures post inoculation, sur les tapis de cellules de la lignée BF2. Pour
cette lignée, l'effet cytopathogène se traduit par un décollement et un arrondissement des
cellules (Figure 2). De plus, cet effet est plus prononcé à 24°C qu'à 18 ou 28°C.
Aucun effet cytopathogène n'a pu être clairement observé pour les autres lignées
cellulaires inoculées.
Des cellules provenant des différentes cultures inoculées ou non ont été préparées par
cytocentrifugation. Après fixation au Carnoy, les lames ont été colorées à l'hémalun-éosine,
l'acridine orange ou par le coloration nucléale de Feulgen et Rossenbeck (Annexe 2). Le reste
des cellules a été fixé et traité pour une analyse en microscopie électronique à transmission.
Malgré l'observation d'un effet cytopathogène prononcé sur les cellules de la lignée
cellulaire BF2, l'analyse des cellules en microscopie photonique et électronique n'a pas permis
de révéler la présence de lésions cellulaires significatives de l'infection virale ni sur ces
cellules BF2, ni sur les autres lignées cellulaires de poisson et d'insecte utilisées pour ces
essais d'infection (Figure 1).
Les anomalies décrites sur ces cultures de cellules peuvent être attribuées à la toxicité
de l'inoculurn vis à vis des cellules. Cependant, l'effet cytopathogène sur les cellules BF2 peut
être observé même à de très fortes dilutions du broyat initial Gusqu'à 10- 10 ), la présence de
substances toxiques dans le broyat de larves virosées, encore nocive pour les cellules à ces
dilutions, parait alors peu probable.
Une autre interprétation de ces résultats peut être formulée. En effet, les anomalies
observées sur les tapis de cellules BF2 peuvent être le résultat du déroulement de certaines
étapes précoces de la réplication virale, correspondant à un cycle abortif (Girard et Hirth,
1989a). Dans ce cas, n'ayant pas décelé la présence de particules virales filles dans les cellules
BF2, l'optimisation des conditions de culture et d'infection pourrait permettre un
développement plus poussé de l'infection virale.
1.2- Optimisation des conditions de culture et d'infection des cellules BF2.
Le succès d'une infection virale in vitro est très dépendant de l'état des cellules au
moment de l'inoculation. En effet, un meilleur rendement d'infection est généralement obtenu
lorsque les cellules sont dans des conditions optimales de croissance (de Kinkelin et al.,
1985).
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