Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
PREAMBULE
Publication 1, en Annexe 1 : Production of monoclonal antibodies aga in st Lymphocystis
Disease Virus (LDV, Iridoviridae). Application to early and reliable LDV titration.
Journal of Fish Diseases
Un travail de DEA ayant été réalisé sur le modèle Lymphocystis Disease Virus (LDV)
des poissons (Le Deuff, 1990) des anticorps monoclonaux étaient disponibles au laboratoire et
ont été caractérisés sur différents isolats de LDV de poissons. L'objectif du travail réalisé
ultérieurement pendant cette thèse, était la validation des réactifs disponibles dans le cadre du
diagnostic des LDV chez les poissons. Ces réactifs ont de plus été testés pour une éventuelle
application diagnostique aux virus apparentés aux Iridoviridae chez les mollusques bivalves.
Des anticorps monoclonaux spécifiques du LDV ont été produits par la méthode
d'hybridation lymphocytaire après immunisation de souris avec des broyats de cellules BF2
(Bluegill Fry) infectées par un virus de type LDV (souche Leetown NFH, isolée de perche,
Micropterus salmoïdes). Cette méthode d'immunisation des souris a été choisie de façon à
obtenir des anticorps dirigés contre des protéines de structure du virus et éventuellement des
protéines non structurales. Dix anticorps monoclonaux spécifiques des cellules BF2 virosées
ont été sélectionnés par la méthode d'immunofluorescence indirecte (IFI). Les dix anticorps
obtenus de cette façon ont été caractérisés en IFI, sur des cultures de cellules de poissons de la
lignée BF2, infectées plus ou moins précocement par le LDV.
Ainsi, la réactivité des dix anticorps spécifiques du LDV a été testée en IFI sur des
tapis de cellules BF2 virosées, fixées un à 15 jours post-infection, et des tapis de cellules BF2
saines. Alors que les cellules saines présentent une coloration rouge, résultant de la fixation du
bleu d'Evans, une fluorescence verte est associée aux cellules vi rosées. Ce marquage peut être
observé selon les anticorps, à partir du deuxième jour ou plus tardivement, jusqu'au huitième
jour après l'infection des cellules. De plus, bien que ce marquage soit toujours limité au
cytoplasme des cellules vi rosées, il peut prendre différents aspects. Il commence généralement
par l'apparition de petits points fluorescents (publication 1 : Figure 2a), puis de spots plus
larges (Publication 1 : Figure 2b). Après plusieurs jours d'infection, le cytoplasme présente
une fluorescence généralisée (Publication 1 : Figure 2c) qui devient de plus en plus intense en
fonction de l'avancement de l'infection virale (Publication 1 : Tableau 2).
Deux de ces anticorps ont été utilisés pour la mise au point d'une méthode de titration
du LDV en IF!. Comparativement à l'observation des effets cytopathogènes du virus, le titrage
par la méthode d'IFI utilisant ces anticorps se montre beaucoup plus sensible et fiable
(Publication 1 : Figure 3).
38