Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

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Figure 2 : Motifs protéiques conservés pour les ADN polymérases de plusieurs Herpesviridae : HSVI Ca), HCMV (/3) et EBV Cr)- Les séquences nucléotidique correspondant sont indiquées ainsi que le calcul de leur dégénérescence CD)_ Motif A: MotifB: MotifC: y - D - G - Q - Q - - R -(Vl - 7 (ou 8l acides aminés o (F) F TAT -GAT -GGA-CAA-CAA-ATT -CGA-GTA GC C T G G CA T TT GAG G CCC 2x2x 2x 4x 2x 2x 3x2x4x2x4 21 mer - > 0 - 3072 23 mer - > 0 - 12 288 1 - 1 - Q - A - H - N - L -( Cl - 7 (ou 8l acides aminés M ATT -ATT -CAA-GCA-CAT -AAT -TTA-TGT C C ATG T CCC G C A A G T C C 3x 3x2x2x2x4x 2x 2x2x4x 2 20 mer - > 0 - 2304 23 mer - > 0 • 92 16 R-V - 1 - Y - G - D - T -( Dl - 7 (ou 8l acides aminés 1 CGA- GTA-ATT -TAT -GGA-GAT -ACA-GAT A T A T C C Te T C G GAG G CCC C 2x4x2x4x 3x 2x 4x 2x 4x 2 21 mer - > 0 • 3072 23 mer - > 0 - 12288 155
1.2.2 - Alignement des séquences DNA binding protein (dbp) virales. De la même façon que pour le gène pol, les séquences de la dbp ont été alignées par le programme Clustal. L'alignement simultané des séquences dbp des virus HSVI, HCMV et EBV, ou de chacune de ces séquences individuellement avec la dbp du CCV n'a pas permis de déterminer de motif consensuel suffisant pour une application à la technique de PCR. Toutefois, d'autres alignements ont été réalisés entre les gènes dbp homologues de virus appartenant à la même sous famille. Ainsi, en comparant les dbp de quatre Alphaherpesvirinae (HSVI, VZV, Bovine Mamillitis Virus et Equine Abortion Virus) puis de deux Belahelpesvirinae (HCMV et Simian Cytomegalovirus) et enfin de deux Gammaherpesvirinae (EBV et Herpesvirus Saimiri), il a été possible de déterminer des motifs apparemment conservés, spécifiques de chacune de ces sous familles (résultats non montrés). Toutefois, aucune séquence consensuelle pour tous les Herpesviridae n'ayant pu être déterminée à partir des séquences de la dbp, ces résultats n'ont pas été retenus pour une application au diagnostic du virus de type herpès de C. gigas. 2 - Préparation de réactifs spécifiques du virus L'obtention de réactifs hétérologues s'avérant peu probante pour une application au diagnostic de l'infection par le virus de type herpès chez C. gigas, la préparation de réactifs spécifiques a été tentée par clonage de l'ADN total extrait d'animaux vi rosés et par immunisation de souris avec des broyats d'animaux virosés. Puis, lorsque des particules virales, purifiées à partir de larves de C. gigas, ont été disponibles, le clonage de l'ADN viral et l'immunisation de souris ont été réalisés à partir d'échantillons de virus purifié. 2.1 - Essais de clonage de fragments du génome viral 2.1.1- Clonage de l'ADN total extrait d'animaux vi rosés. L'ADN total contenu dans des échantillons de C. gigas a été extrait (Annexe 2) à partir d'animaux adultes sains, juvéniles virosés et larves virosées. Dans un premier temps, la séparation des ADN viral et cellulaire sur gradient de CsCI en présence de colorant de Hoechst N°33258 (Annexe 2) a été tentée. En effet, le colorant de Hoechst N°33258 s'intercale spécifiquement entre les bases A et T de l'ADN, et de cette façon modifie la densité de l'ADN proportionnellement à sa composition. L'application de cette propriété à la séparation d'ADN d'origines différentes est possible si ces ADN présentent des pourcentages en bases A et T suffisamment éloignés. L'agent intercalant amplifie alors la différence de densité de ces ADN en se fixant en plus grande quantité sur les molécules d'ADN contenant le plus fort pourcentage de A et T (Karlowski el al., 1987). En outre, le colorant de Hoechst confère une fluorescence aux molécules d'ADN et ainsi permet de visualiser les bandes lorsque le gradient est observé sous lumière ultraviolette. Les résultats obtenus sont schématisés Figure 3. Selon les échantillons, une, deux ou trois bandes contenant de l'ADN peuvent être visualisées après centrifugation des gradients de CsCI. Les échantillons d'ADN extraits d'animaux sains et de certains échantillons d'animaux virosés donnent lieu à l'obtention de une ou deux bandes selon les lots. Quelques lots d'ADN 156
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