Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

1.2.2 - Alignement des séquences DNA binding protein (dbp) virales.
De la même façon que pour le gène pol, les séquences de la dbp ont été alignées par le
programme Clustal.
L'alignement simultané des séquences dbp des virus HSVI, HCMV et EBV, ou de
chacune de ces séquences individuellement avec la dbp du CCV n'a pas permis de déterminer
de motif consensuel suffisant pour une application à la technique de PCR.
Toutefois, d'autres alignements ont été réalisés entre les gènes dbp homologues de
virus appartenant à la même sous famille. Ainsi, en comparant les dbp de quatre
Alphaherpesvirinae (HSVI, VZV, Bovine Mamillitis Virus et Equine Abortion Virus) puis de
deux Belahelpesvirinae (HCMV et Simian Cytomegalovirus) et enfin de deux
Gammaherpesvirinae (EBV et Herpesvirus Saimiri), il a été possible de déterminer des motifs
apparemment conservés, spécifiques de chacune de ces sous familles (résultats non montrés).
Toutefois, aucune séquence consensuelle pour tous les Herpesviridae n'ayant pu être
déterminée à partir des séquences de la dbp, ces résultats n'ont pas été retenus pour une
application au diagnostic du virus de type herpès de C. gigas.
2 - Préparation de réactifs spécifiques du virus
L'obtention de réactifs hétérologues s'avérant peu probante pour une application au
diagnostic de l'infection par le virus de type herpès chez C. gigas, la préparation de réactifs
spécifiques a été tentée par clonage de l'ADN total extrait d'animaux vi rosés et par
immunisation de souris avec des broyats d'animaux virosés. Puis, lorsque des particules
virales, purifiées à partir de larves de C. gigas, ont été disponibles, le clonage de l'ADN viral
et l'immunisation de souris ont été réalisés à partir d'échantillons de virus purifié.
2.1 - Essais de clonage de fragments du génome viral
2.1.1- Clonage de l'ADN total extrait d'animaux vi rosés.
L'ADN total contenu dans des échantillons de C. gigas a été extrait (Annexe 2) à partir
d'animaux adultes sains, juvéniles virosés et larves virosées.
Dans un premier temps, la séparation des ADN viral et cellulaire sur gradient de CsCI
en présence de colorant de Hoechst N°33258 (Annexe 2) a été tentée. En effet, le colorant de
Hoechst N°33258 s'intercale spécifiquement entre les bases A et T de l'ADN, et de cette façon
modifie la densité de l'ADN proportionnellement à sa composition. L'application de cette
propriété à la séparation d'ADN d'origines différentes est possible si ces ADN présentent des
pourcentages en bases A et T suffisamment éloignés. L'agent intercalant amplifie alors la
différence de densité de ces ADN en se fixant en plus grande quantité sur les molécules
d'ADN contenant le plus fort pourcentage de A et T (Karlowski el al., 1987). En outre, le
colorant de Hoechst confère une fluorescence aux molécules d'ADN et ainsi permet de
visualiser les bandes lorsque le gradient est observé sous lumière ultraviolette.
Les résultats obtenus sont schématisés Figure 3. Selon les échantillons, une, deux ou
trois bandes contenant de l'ADN peuvent être visualisées après centrifugation des gradients de
CsCI. Les échantillons d'ADN extraits d'animaux sains et de certains échantillons d'animaux
virosés donnent lieu à l'obtention de une ou deux bandes selon les lots. Quelques lots d'ADN
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