Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

Du fait de la présence d'une coquille, la dissociation des tissus larvaires est moins aisé.
Différents essais ont été réalisés afin de faciliter le broyage préalable de la coquille des larves.
Le broyage direct des échantillons à l'Ultra-Turrax et/ou à l'aide d'un tube de Potter ne
donne pas un résultat satisfaisant.
Une décalcification préalable des échantillons par l'EDT A disodique à 5% pendant
deux à quatre heures, s'est avéré efficace pour réaliser un broyage des larves en alternant
l'utilisation de l'Ultra-Turrax et d'un tube de Potter. Les étapes ultérieures de purification n'ont
cependant permis d'obtenir qu'une suspension enrichie en particules virales incomplètes
(capsides vides).
Seuls des échantillons faiblement vi rosés étaient disponibles lors de ces essais, ce qui
peut expliquer en partie ces résultats. Toutefois, le protocole de décalcification des larves par
l'EDT A n'a pas été retenu car il est possible que ce traitement altère les particules virales. En
effet, l'EDTA est un agent chélateur des ions divalents, et en modifiant la composition du
milieu, peut être responsable de la dissociation même partielle des capsides et nucléocapsides
virales.
Des essais ont été réalisés ultérieurement sans décalcification préalable par l'EDT A,
mais en utilisant du sable de Fontainebleau (R.P. Hedrick et S. Chilmonczik, communication
personnelle). Ce sable, très fin, permet un broyage efficace des tissus larvaires car les
coquilles sont elles mêmes finement broyées.
Les proportions retenues après plusieurs essais sont: deux grarnrnes de sable de
Fontainebleau par grarnrne de larves, additionnés de 15 ml de tampon (volume final
minimum). Les larves vi rosées (IX g) sont broyées une première fois à l'Ultra-Turrax en
présence de 2X g de sable et 5X ml de tampon, puis ce broyat grossier est dilué par addition
de 10X ml de tampon et broyé une seconde fois à l'Ultra-Turrax.
4 - Filtration et clarification des broyats
Les gros débris et éventuellement les résidus de coquille et de sable présents dans les
broyats sont éliminés par des étapes successives de filtration (Hervio, 1992) et de clarification
par centrifugation à basse vitesse.
Après plusieurs essais, le protocole retenu est la filtration des broyats successivement
sur des tamis de 250 J.Im et 60 J.Im. Le broyat filtré est ensuite clarifié par trois centrifugations
de 30 minutes à des vitesses croissantes (250 g, 1000 g et 4000 g) de façon à éliminer
progressivement les gros débris.
5 - Fractionnement des broyats
Les broyats filtrés et clarifiés sont concentrés par ultracentrifugation à 200 000 g
pendant une heure. Le culot obtenu, contenant les particules virales et différents constituants
cellulaires, est remis en suspension dans un volume de 5 ml de tampon pour 1 à 2 g de larves
ou de tissus initiaux. La dissociation totale du culot est facilitée par une agitation à froid (30
minutes à une heure) à l'aide d'un agitateur magnétique.
Différents essais ont conduit à choisir un fractionnement de la suspension obtenue cidessous
sur un gradient de saccharose discontinu (Hayashi el al. , 1986 ; Hayashi el al., 1988 ;
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