Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

visualisées sur les dépôts d'ADN sain (1 Ilg à 0,1 ng), quelle que soit la sonde utilisée. La
meilleure sensibilité a été obtenue pour les sondes pl4 (2200 pb) et p35 (1000 pb). Il est en
effet possible de visualiser l'hybridation de ces sondes marquées à la peroxydase, sur des spots
de 1 ng ou plus d'ADN extrait de virus purifié (soit 8.10- 6 pmole) et sur des spots de 10 à 100
pg de plasmide recombinant, soit 38.10-6 pmole de p35 (100 pg peuvent être détectés) et
2,9.10- 6 pmole de pl4 (10 pg peuvent être détectés).
L'hybridation sur les ADN extraits des différents lots d'animaux vi rosés présente des
niveaux d'intensité variable, reflétant le taux d'infection plus ou moins important selon les
lots. La sensibilité de la détection est de 100 ng pour l'ADN total extrait de naissain virosé et
de 1 flg à lOng pour l'ADN total extrait des quatre lots de larves virosées.
Ces résultats montrent une sensibilité et une spécificité pour cette méthode telles qu'il
est possible d'envisager une application directe de ce protocole dans un diagnostic de routine.
De plus, cette méthode de dot blot est reproductible et relativement simple à mettre en oeuvre.
Avant de pouvoir être utilisé à des fins diagnostiques, ce protocole nécessite
néanmoins d'être validé par une étude comparative des analyses en histologie, en microscopie
électronique et en dot blot. Les améliorations qui pourront y être ultérieurement apportées
concerneront d'une part la préparation des échantillons. Celle ci pourrait être réalisée à partir
de protocoles d'extraction plus rapides que ceux utilisés pour les premiers essais. D'autre part,
la sensibilité de la détection pourra, si cela s'avère nécessaire, être accrue en utilisant d'autres
méthodes de marquage, en particulier utilisant la radioactivité.
Les perspectives diagnostiques de ce travail sont de plus, la mise au point du dépistage
de l'infection par hybridation in situ. L'application de cette méthode en complément des
méthodes immunologiques permettrait en effet la détection d'infections virales exprimées. Ce
travail est en cours et les premiers résultats, prometteurs, permettent d'envisager non
seulement le diagnostic d'infections virales aiguës, mais aussi, après séquençage de fragments
clonés et amplification par PCR, le diagnostic des stades d'infection où le virus est présent
sous une forme latente ou peu productive. L'application prophylactique de ces méthodes sera
alors de dépister l'infection dans les lots de larves et de naissains avant leur commercialisation
ou chez les géniteurs et leurs pontes avant fécondation.
De plus, une quantité importante d'ADN de haut poids moléculaire a été purifiée et
permettra de réaliser rapidement une banque d'expression et/ou une banque génomique virale.
Les perspectives de ce travail sont nombreuses et relèvent de domaines appliqués, tels que la
préparation de réactifs spécifiques de diagnostic, mais aussi de recherches plus fondamentales,
en permettant notamment de comparer ce virus apparenté aux Herpesviridae, pathogène de
mollusques bivalves, avec des virus proches, pathogènes de poissons ou de mammifères.
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