Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

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extraits d'animaux vi rosés permettent de visualiser une troisième bande, en position basse, sur le gradient de CsCI. Plusieurs origines peuvent être attribuées à ces différentes bandes. Leur répartition suggère que la bande majeure (bande haute) représente l'ADN génomique de C. gigas. La bande en position moyenne, de moindre intensité peut, elle, correspondre à l'ADN satellite ou mitochondrial de C. gigas (Garber et Yoder, 1983 ; Mc Cutchan et al. 1984). La bande la plus basse, d'intensité similaire à celle de la bande moyenne, peut être d'origine virale ou provenir de contaminants tels que des bactéries, qui sont en effet présentes en grand nombre dans les tissus des animaux vi rosés morts et moribonds utilisés pour ces extractions d'ADN. Toutefois, rien n'indique que l'ADN viral ne soit pas localisé au niveau des deux autres bandes, en mélange avec un ADN d'une autre origine, ou même dans une zone du gradient où il est en concentration trop faible pour être visualisé. Les différentes bandes d'ADN ont toutefois été prélevées sur ces gradients afin de comparer leurs profils de migration en gel d'agarose, avant et après digestion par des enzymes de restriction. Après électrophorèse, les ADN non digérés apparaissent soit sous la forme d'une bande de haut poids moléculaire (bande haute et bande moyenne), soit sous la forme de traînées ("smears") reflétant une dégradation importante (bande basse). Après électrophorèse des ADN provenant de ces trois bandes et digérés par EcoR l ou Kpn l, des traînées d'ADN sont visualisés sans qu'il soit possible de différencier les lots par l'observation de fragments de restriction nettement séparés (résultats non montrés). L'analyse des ADN par digestion enzymatique et électrophorèse n'ayant pas permis d'attribuer une origine plus précise aux différentes bandes séparées sur les gradients de CsCI, la possibilité de pouvoir séparer l'ADN viral de l'ADN cellulaire a été abandonnée. Le clonage de l'ADN total extrait d'animaux vi rosés a été réalisé dans un plasmide Bluescript KS-. Après digestion partielle par l'enzyme Sau IIIa, les fragments d'ADN ont été fractionnés en fonction de leur taille, sur un gradient de saccharose 10-40%. Les fragments à bords francs de taille comprise entre 500 et 4000 pb ont été ligaturés dans un plasmide Bluescript KS- préalablement linéarisé par l'enzyme Xho 1. Des bactéries DH5a compétentes, transformées par ce mélange de ligature, ont été sélectionnées sur un milieu additionné d'ampicilline, X-Gal et IPTG. Les plasmides produits par ces clones bactériens ont été caractérisés par double digestion enzymatique (Kpn l et Sac 1) et électrophorèse en gel d'agarose. Environ 250 clones ont été sélectionnés et caractérisés de cette façon. Toutes les étapes de ce travail sont détaillées en annexe. La spécificité des fragments clonés a été testée par hybridation sur dot-blot. Des dilutions 1/10 en série d'ADN extrait d'animaux sains ou virosés ont été déposées à l'aide d'un manifold, sur une membrane de nylon, de façon à réaliser des spots contenant de lOng à 1 fg d'ADN (Annexe 2). Les sondes sont hybridées après marquages à la peroxydase et la révélation est réalisée à l'aide d'un substrat luminescent (kit ECL, Amersham). La démarche choisie nécessitant de tester la spécificité d'un grand nombre de fragments clonés, ceux ci ont été regroupés par lots de cinq fragments de tailles similaires qui sont testés conjointement. L'hybridation étant réalisée sur des dilution en série (10 ng à 1 fg) d'ADN extrait d'animaux sains et vi rosés, permet d'obtenir un résultat quantitatif. Dans ce cas, dans l'hypothèse d'un lot de sondes contenant au moins un fragment spécifique de l'ADN 157
viral, des spots d'intensité plus importante sont attendus au niveau des dépôts d'ADN extrait d'animaux virosés comparativement aux dépôts témoins d'ADN extrait d'animaux sains. Ce protocole a été établi en supposant l'ADN viral être en multiple copie par rapport à l'ADN cellulaire présent dans les échantillons provenant d'animaux virosés. Ce procédé n'a toutefois pas permis de sélectionner de fragments s'hybridant spécifiquement à l'ADN extrait d'animaux virosés. Figure 3 : Essais de séparation des ADN viral et cellulaire sur gradient de chlorure de césium. 3a et 3b : Schémas des bandes observées sur les gradients obtenus pour certains échantillons d'ADN provenant d'animaux sains et virosés, dans ce cas une ou deux bandes sont visibles. 3c : Schéma des bandes observées sur les gradients obtenus pour certains échantillons d'ADN provenant d'animaux virosés, pour ceux-ci, trois bandes sont visibles. fi fi 3a 3b ADN extrait d'animaux sains ou vi rosés 158 n Bande majeure - 1 0 bande mineure - 2 0 bande mineure 3c ADN extrait d'animaux virosés
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