Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

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cellules se fixent en plus grand nombre s'étalent et semblent pousser. Elles se conservent environ huit jours. D'autre part, en eau de mer filtrée, les cellules assez nombreuses, s'étalent bien au bout de trois jours et dans ce milieu, elles subsistent plus longtemps en bon état (plus de huit jours). Des tests répétés confirmant ces résultats, il semble que l'eau de mer soit un bon milieu de conservation des cellules mais ne contenant que très peu d'éléments nutritifs, alors que le milieu LIS (3X) assure une moins bonne conservation des cellules mais contient des éléments nutritifs. Il a donc été testé, en fonction de ces observations, des mélanges de milieu LIS (3X) et d'eau de mer filtrée stérile. Pour les fioles contenant des mélanges de ratio 3:2 et 2:3, les résultats obtenus au bout de dix jours tendent à prouver que les deux milieux sont complémentaires. En effet, les cellules s'étalent au bout de trois jours, des foyers de cellules de type fibroblastique apparaissent, les cellules s'étalent et ne meurent qu'au bout d'une dizaine de jours. Il reste encore des cellules fixées au bout de 15 jours de culture. Pour des mélanges de ratio 1:4 et 4: l, les résultats sont comparables à ceux des tests avec les milieux purs. Ces essais de primoculture sont répétés avec des quantités de cellules croissantes, pour essayer d'obtenir un tapis cellulaire confluent. Les premiers essais étaient réalisés en inoculant les cellules provenant de 1,7 ventricules par fiole de 25 cm 2 . De meilleurs résultats, en termes de croissance cellulaire, ont été obtenus lorsque les cellules provenant de 3,5 ventricules étaient inoculés par fiole de 25 cm 2 . En effet, un grand nombre de cellules meurent lors des deux premiers jours. Il est donc nécessaire de réaliser un inoculum de départ suffisant dans les fioles de culture. Un nombre important de cellules ancrées au fond des fioles produit un micro environnement qui favorise la croissance cellulaire (Gumbiner el al., 1993 ; Watson el al., 1987). En effet, certaines cellules sécréteraient dans le milieu de culture, des substances nécessaires au développement d'autres types cellulaires. Un tel phénomène de coopération cellulaire nécessite qu'un plus grand nombre de cellules soient ensemencées dans les fioles. De plus, afin de favoriser la fixation des cellules dans les fioles de culture, des tests ont été réalisés en prétraitant ces fioles par la poly-D-lysine. Dans les premiers jours de culture, la différence entre les fioles témoin et les fioles traitées à la poly-D-lysine, n'est pas visible. Par contre au bout de six à sept jours, les cellules des fioles témoins se décrochent et les cellules restées fixées présentent un état de conservation médiocre par rapport aux cellules dans les fioles traitées à la poly-D-lysine. L'environnement extracellulaire est d'une grande importance puisqu'il influence le métabolisme cellulaire et la structure du cytosquellette, donc également la morphologie des cellules in vivo et in vitro (Alberts el al., 1983). D'autre part, le traitement des fioles à la poly D-lysine favorise l'ancrage des cellules, ce qui est un facteur nécessaire à la division de nombreux types de cellules (Watson el al., 1987). En plus des conditions décrites précédemment, les milieux de culture contenus dans les fioles sont éliminés chaque jour, les tapis cellulaires sont rincés et le milieu est renouvelé régulièrement. Cette opération permet l'élimination des cellules mortes, non fixées, dont la dégradation peut entraîner la libération de produits toxiques. En dernier lieu, en supposant la présence de facteurs de croissance et d'éléments nutritifs dans l'hémolymphe des huîtres (Sevala, 1993), des milieux de culture, L-15(3X):eau de mer (1: 1), supplémentés par différentes quantités (l,Sou 10%) de sérum de veau foetal 123
(SVF) et/ou d'hémolymphe de Crassastrea gigas (HCG, hémolymphe sans cellules, filtré sur 0,22 j,lm) ont été testés. Le milieu donnant les meilleurs résultats est supplémenté par 10% de SVF et 5% de HCG. Avec ce milieu, il est possible d'obtenir des tapis cellulaires quasi confluents qui se conservent bien pendant au moins 15 jours (Publication 7 : Figures 1 et 2). L'analyse en microscopie électronique à transmission de ces cellules en culture et des cellules de coeur in situ, dans l'organe non dissocié, a été réalisée. Différents types cellulaires présents dans les cultures ont été identifiés. Ce sont des cardiomyocytes (Publication 7 : Figure 3), des cellules de type fibroblastique (Publication 7 : Figure 4) et des cellules pigmentées (Publication 7 : Figure 5). D'autres types cellulaires sont présents, certains pouvant correspondre à des hémocytes (Publication 7 : Figure 6). La comparaison de ces cellules en culture et des cellules in situ, dans le ventricule non dissocié, montre que l'ultrastructure des cellules en culture est relativement bien conservée, ce qui semble refléter leur bon état physiologique. Toutefois, les cellules pigmentées en culture sont moins pigmentées que les cellules observées in vivo. Elles ont probablement relargué une partir de leurs pigments dans le milieu de culture. D'autre part, quelques cellules présentent des figures myélinoïdes, résultant de l'accumulation de produits de dégradation (Publication 7 : Figure 7). L'obtention de monocouches cellulaires quasi confluentes, ayant une durée de vie d'au moins 15 jours, rend possible d'envisager l'inoculation de broyats de larves infectées et la visualisation d'éventuels effets cytopathogènes du virus dans un système cellulaire homologue. Ce protocole, reproductible pour l'obtention de primo cultures de cellules cardiaques d'huîtres creuses C. gigas a été adapté ultérieurement d'une part, à la primoculture de cellules cardiaques d'huîtres plates, 0. edulis (publication 8) et d'autre part, ce protocole a été adapté à la primoculture d'hémocytes d'huîtres plates, 0. edulis (Perroquin, 1995). 124
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