Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

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Seal et St Jeor, 1988 ; Kanto et al., 1994). De cette façon, les particules sont séparées en fonction de leur taille et les différent types de particules virales (capsides, nucléocapsides et particules enveloppées) co-sédimentent à la même interface. Le gradient retenu comporte cinq phases de densités décroissantes depuis le fond du tube: 60% (6 ml), 50% (5 ml), 40% (6 ml), 30% (6 ml) et 10% (5 ml). Le volume total des gradients est donc de 28 ml. Cinq à 6 ml de suspension concentrée sont déposés sur chacun de ces gradients, le volume final est alors de 33 à 34 ml. Il s'est avéré nécessaire de multiplier les tubes de façon à ne pas déposer trop de matériel sur chaque gradient. En effet, lorsque le dépôt est trop concentré, la séparation des particules est moins efficace, les particules virales pouvant être alors "retenues" par les particules plus petites ou "entraînées" par les particules plus grosses. Le résultat de ce phénomène est la dilution des particules virales le long de tout le gradient et en conséquence une perte des particules virales. Après centrifugation à 80 000 g pendant 30 minutes, les interfaces sont prélevées, diluées deux à quatre fois par addition goutte à goutte d'eau de mer, afin de ne pas provoquer un choc osmotique trop violent (Hervio, 1992). Les particules contenues dans chaque interface sont alors mises au culot par centrifugation à 300000 g pendant Ih30. Les culots obtenus sont contrôlés en microscopie électronique à transmission. Les premiers essais, réalisés par la méthode de coloration négative (Annexe 2), après dissolution du culot en eau de mer, se sont avérés difficiles à interpréter (Figure 1). C'est pourquoi, les contrôles ultérieurs ont été réalisés en prélevant une partie des culots obtenus, non dissociés. Ces pièces sont alors observées en microscopie électronique après inclusion en résine Epon, coupe ultra-fine et contraste à l'acétate d'uranyle et au citrate de plomb (Annexe 2). Ce procédé relativement long à réaliser permet néanmoins d'effectuer un contrôle fiable de chaque fraction et notanunent de vérifier la bonne conservation des particules virales purifiées. Les particules virales purifiées sont prélevées à l'interface 40-50% du gradient de saccharose (Figure 2). L'interface 30-40% peut également contenir quelques virions, mais celles-ci sont mélangées à de nombreux débris cellulaires. Une purification plus poussée peut être réalisée en déposant la fraction 40-50% sur un deuxième gradient de saccharose identique aux premiers. Dans ce cas, les interfaces 40-50% de tous les premiers gradients sont regroupées et diluées. Après mise au culot (300 000 g, 1 h30), les particules virales sont resuspendues dans l'eau de mer et déposées sur un seul gradient de saccharose. La centrifugation, le prélèvement et la mise au culot du virus purifié sont réalisés comme précédemment. Le protocole final de purification, ayant donné des résultats reproductibles, est schématisé dans la Figure 3. Les purifications réalisées à partir de larves de C. gigas ont permis d'une part d'immuniser des souris BaibC par voie intrapéritonéale, avec du virus purifié (Chapitre VI). D'autre part, ces purifications ont permis l'extraction d'ADN viral de haut poids moléculaire (non dégradé). La caractérisation et le clonage de l'acide nucléique viral sont décrits dans le chapitre VI. 142
• " (1 - " 100nm 100nm Figures 1 et 2 : Les différentes étapes de la purification du virus de type herpès sont contrôlées en microscopie électronique à transmission, selon deux méthodes. 1 : Méthode de coloration négative à l'acide phosphotungstique, réalisée à partir de suspensions de particules. 2 : Fixation et inclusion des pièces en résine Epon. Les coupes ultrafines sont contrastées à l'acétate d'uranyle et au citrate de plomb. Les flèches indiquent l'emplacement de patiicules virales. 143
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