Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

2 - Essais d'infection de primocultures de cellules d'huître creuse, Crassostrea
gigas
2.1 - Mise au point d'un protocole de primocuIture de cellules cardiaques d'huître
creuse, Crassostrea gigas
La reproduction de l'herpèsvirus ne donnant pas de résultats immédiats et simples
d'interprétation et nécessitant de faire appel pour confirmation aux techniques histologiques et
à la microscopie électronique, il est apparu intéressant de visualiser les éventuels effets
cytopathogènes, dus à ce virus sur des cellules d'huître en culture. En effet, le choix d'un
système homologue, plutôt que d'un système hétérologue semblerait plus adapté aux
recherches menées.
Or, il n'existe pas de lignée cellulaire d'huître disponible actuellement. Le travail
entrepris à donc consisté à tenter d'adapter une technique permettant d'obtenir des
primocultures de cellules fibroblastiques d'huître (Cousserans et al., 1974). En effet les
particules virales (herpèsvirus-like) sont observées chez les larves d'huîtres creuses dans les
cellules fibroblastiques du vélum et l'ensemble des caractères observés de ce virus le font
rapprocher des Betaherpesvirus qui ont un fort tropisme vis à vis des cellules de type
fibroblastique.
Plusieurs facteurs sont liés à l'obtention de primocultures : le choix des tissus, le mode
de dissociation mécanique et la protéase utilisée, le milieu de culture et les facteurs de
croissance présents dans le milieu, les facteurs favorisant l'ancrage des cellules (Alberts et al.,
1983 ; Watson et al., 1987 ; Gumbiner et al., 1993).
Différents tissus riches en fibroblastes ont été testés : la membrane péricardique, le
manteau et le coeur. Différents facteurs ont été testés afin d'obtenir une dissociation des tissus
et des cellules maximale. Ils correspondent à l'utilisation de protéases (trypsine et collagénase)
à différentes concentrations et à des techniques de dissociation mécaniques utilisant un
broyeur de type Dounce ou une pipette automatique de 500 Ill. La technique retenue après de
nombreux essais permet d'obtenir une bonne dissociation des tissus et une assez bonne
conservation des cellules. Cette méthode est détaillée dans l'article joint.
Une fois ce protocole de dissociation établi, il a été nécessaire de définir quel était le
tissu le plus intéressant pour l'obtention de fibroblastes. La membrane péricardique est un
tissu d'assez petite taille et ne contenant que peu de cellules. Quant aux essais effectués sur le
manteau, ils donnent un assez grand nombre de cellules, mais posent un problème de
dissociation, car la technique mise au point précédemment ne suffit pas à dissocier totalement
les cellules, et une dissociation plus poussée ne permet pas d'obtenir des cellules en assez bon
état pour être mises en culture. Par contre, les essais de dissociation effectués sur du ventricule
cardiaque d'huître, donnent de bons résultats.
Les travaux ultérieurs de mise au point d'un milieu de culture ont donc été réalisés à
partir de cet organe. Les cellules dissociées de ventricule cardiaque ont été mises en culture
dans des milieux synthétiques (milieu de Leibovitz : L-15 et 199), préparés trois fois
concentrés (3X) afin d'obtenir une osmolarité compatible avec celles des cellules d'huître, ou
bien dans de l'eau de mer.
La croissance cellulaire en milieu 199 est limitée et la survie des cellules n'est que de
quelques jours (cinq à huit jours). Les deux premiers jours les cellules se fixent et s'étalent,
mais ensuite, elles meurent assez rapidement. Par contre, en milieu de Leibovitz (LI5), les
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