Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

Chapitre V : Mise au point d'un protocole de purification des
particules virales
L'étude des virus de mollusques marins est actuellement limitée à des données
essentiellement descriptives (Farley, 1978 ; Couch, 1981 ; Johnson, 1984 ; Comps, 1988). Cet
état de fait peut être expliquée par la difficulté d'approvisionnement en matériel virosé, liée en
grande part à l'impossibilité de propager ces virus in vitro, sur des cellules en culture (Comps,
1988).
De ce fait, aucun virus pathogène de mollusques marins n'a pu être purifié et aucun
protocole de référence, détaillant les différentes étapes de purification de particules virales à
partir de tissus de bivalves, n'est disponible.
La purification de virions à partir de tissus d'animaux a cependant pu être réalisée dans
de nombreux cas (Girard et Hirth, 1989b). Toutefois, le succès de ces purifications est lié à
l'obtention d'organes ou de tissus relativement riches en virus.
Un protocole de purification de particules virales de type herpès a été mis au point à
partir d'animaux infectés. Les contrôles de ces essais ont été réalisés en microscopie
électronique par coloration négative ou double contraste sur coupes, après inclusion des
fractions en résine Epon (Annexe 2).
Toutes les étapes détaillées ci dessous sont réalisées à 4°C.
1 - Choix et conservation du matériel virosé
Dans le cas du virus de type herpès observé chez C. gigas, les animaux infectés
appartiennent à deux classes d'âge: les larves et le naissain (Nicolas et al., 1992 ; Hine et al.,
1992 ; Renault et al., 1 994a et 1994b). Des essais de purification ont donc été tentés à partir
de larves et de naissain virosés.
Les essais de purification ont été réalisés à partir de naissains de C. gigas, en
choisissant des animaux moribonds dans les lots présentant des mortalités suspectes. Chez le
naissain, l'infection virale se développe essentiellement dans les cellules conjonctives de
différents tissus : le manteau, les branchies, la glande digestive, le muscle et les palpes
labiaux. Cependant, l'infection se déroule rarement dans tous ces tissus simultanément et
relativement peu de cellules sont infectées (Renault et al., 1994a). Pour ces raisons, les essais
ont été effectués à partir d'animaux entiers. Cependant, les tests réalisés n'ont pas abouti à
l' obtention de particules purifiées.
Les larves constituent un matériel de départ beaucoup plus riche en particules virales,
puisque dans le cas d'une infection aiguë, presque toutes les cellules peuvent être virosées. La
principale difficulté réside cependant dans l'obtention d'une quantité de larves suffisante,
présentant un stade d'infection adéquat. En effet, si les échantillons sont prélevés trop
précocement après le début des symptômes, relativement peu de particules virales sont
présentes dans les tissus. A l'inverse, des cellules virosées et des portions entières de vélum se
détachent des larves au cours de l'infection. Le prélèvement des animaux étant réalisé par
tamisage, seuls les tissus et les cellules encore présents dans les coquilles peuvent être
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