Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

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H20 2 30% Tampon Tris 60 111 200 ml Solution d'arrêt Acide sulfurique 1 ml H 20 50 ml Ajouter goutte à goutte l'acide dans l'eau, sous une hotte chimique. Détection des I,dycoprotéines Marquage à la concanavaline A (ConA) 1 - Saturer la membrane de nitrocellulose par un bain de tampon tris contenant 5% de Tween20, deux heures à 47°C. 2 - Laver rapidement en tampon Tris. 3 - Incuber avec la ConA (500 l1g/ml en tampon Tris), pendant 30 minutes. La ConA se fixe sur les résidus glycosylés qui lui sont spécifiques. 4 - Laver trois fois en tampon tris. 5 - Incuber avec la peroxydase (250 mg/ml en tampon tris), pendant 30 minutes. La ConA ayant une grande affinité pour cette enzyme, elle se fixe sur la membrane, là où est localisée la ConA 6 - Laver trois fois en tampon Tris. 7 - Révéler par addition d'un substrat chromogène de la peroxydase (diaminobenzidine ou chloronaphtol), plusieurs minutes. Des bandes de coloration respective brune ou violette apparaissent, elles correspondent à la présence de glycoprotéines. 8 - Lorsque la coloration est intense, arrêter la réaction par un bain d'acide sulfurique dilué, pendant trois minutes, puis rincer à l'eau distillée. 9 - Les membranes peuvent être conservées dans un film SaranVrap et à l'obscurité, toutefois la coloration s'estompe après plusieurs semaines. Marquage à l'aide de lectines couplées à la peroxydase Des lectines couplées chimiquement à la peroxydase sont commercialisées (Sigma). Elles peuvent être utilisées pour la détection des glycoprotéines sur membrane selon le même protocole que pour la ConA à l'exception des étapes 5 et 6. 4 • Méthodes immunologiques 4.1 - Méthode de double diffusion Réactifs Gels Véronal sodique (barbital) 0,03 M Agarose 0,8% Azide de sodium 0,1% Dissoudre le véronal dans de l'eau distillée, puis ajuster le pH à 8,2. Ajouter l'agarose, porter à ébullition, puis placer au bain-marie à 50°C. Lorsque le gel est refroidi à 50°C, ajouter le NaN3. Tampon de lavage Tris 10mM 219
NaCI NaN) Ajuster le pH à 7 Tampon de coloration Bleu de Coomasie Ethanol absolu Acide acétique Tampon de décoloration Ethanol absolu Acide acétique l50mM 0,01% 0,1% 40% 10% 40% 10% Double diffusion Préparation des gels 1 - Dégraisser à l'alcool des lames de verre non dépolies. 2 - Couler 5 ml de gel sur chaque lame. Lorsque l'agarose a refroidi, il devient alors légèrement opaque. 3 - Découper à l'aide d'un emporte-pièces des puits de 3 mm de diamètre, distants de 8 mm. 4 - Déposer 10 ,.L1 de solution d'antigènes ou d'anticorps dans chaque puits. 5 - Placer les lames dans une chambre humide à température ambiante, et observer quotidiennement la formation éventuelle d'arcs de précipitation. Celle ci dépend des concentrations respectives et relatives d'antigènes et d'anticorps. De plus, elle dépend du type d'immunoglobuline. Séchage et coloration des gels Après complet développement des lignes de précipitation (24 à 72h), les gels sont lavés, séchés et colorés: 1 - Trois bains de 2h en tampon de lavage. 2 - Un bain de 2h en eau distillée. 3 - Recouvrir les gels de papier filtre et placer en étuve à 60-80°C, jusqu'à complet séchage. Oter délicatement le papier filtre. 4 - Colorer une nuit au bleu de Coomasie, puis décolorer pour éliminer l'excès de colorant. 4.2 - Western blotting Réactifs Tampon Tris NaCI Tris-HCl Ajuster le pH à 7,5 Réactifs de saturation Lait écrémé en poudre (Régilait) Tween 20 150 mM 50 mM 220
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