Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

H20 2 30%
Tampon Tris
60 111
200 ml
Solution d'arrêt
Acide sulfurique 1 ml
H 20 50 ml
Ajouter goutte à goutte l'acide dans l'eau, sous une hotte chimique.
Détection des I,dycoprotéines
Marquage à la concanavaline A (ConA)
1 - Saturer la membrane de nitrocellulose par un bain de tampon tris contenant 5% de
Tween20, deux heures à 47°C.
2 - Laver rapidement en tampon Tris.
3 - Incuber avec la ConA (500 l1g/ml en tampon Tris), pendant 30 minutes. La ConA
se fixe sur les résidus glycosylés qui lui sont spécifiques.
4 - Laver trois fois en tampon tris.
5 - Incuber avec la peroxydase (250 mg/ml en tampon tris), pendant 30 minutes. La
ConA ayant une grande affinité pour cette enzyme, elle se fixe sur la membrane, là où
est localisée la ConA
6 - Laver trois fois en tampon Tris.
7 - Révéler par addition d'un substrat chromogène de la peroxydase (diaminobenzidine
ou chloronaphtol), plusieurs minutes. Des bandes de coloration respective brune ou
violette apparaissent, elles correspondent à la présence de glycoprotéines.
8 - Lorsque la coloration est intense, arrêter la réaction par un bain d'acide sulfurique
dilué, pendant trois minutes, puis rincer à l'eau distillée.
9 - Les membranes peuvent être conservées dans un film SaranVrap et à l'obscurité,
toutefois la coloration s'estompe après plusieurs semaines.
Marquage à l'aide de lectines couplées à la peroxydase
Des lectines couplées chimiquement à la peroxydase sont commercialisées (Sigma).
Elles peuvent être utilisées pour la détection des glycoprotéines sur membrane selon le
même protocole que pour la ConA à l'exception des étapes 5 et 6.
4 • Méthodes immunologiques
4.1 - Méthode de double diffusion
Réactifs
Gels
Véronal sodique (barbital) 0,03 M
Agarose 0,8%
Azide de sodium 0,1%
Dissoudre le véronal dans de l'eau distillée, puis ajuster le pH à 8,2.
Ajouter l'agarose, porter à ébullition, puis placer au bain-marie à 50°C.
Lorsque le gel est refroidi à 50°C, ajouter le NaN3.
Tampon de lavage
Tris 10mM
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