Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

More documents

Recommendations

Info

Chapitre 1 : Mise en évidence et description du virus Publication 3 : Herpes-Iike virus infecting Japanese oyster (Crassostrea gigas) spat. Bulletin ofthe European Association of Fish Pathologists Publication 4 : Herpesviruses associated \Vith mortalities among Pacific oyster, Crassosfrea gigas, in France - Comparative study. Revue de Médecine Vétérinaire Ce chapitre décrit différents résultats d'analyses effectués de 1992 à 1995 à l'Unité de Recherche en Pathologie et Immunologie Générales (URPIG, station IFREMER de La Tremblade), auxquels j'ai contribué dans le cadre de cette thèse. 1 • Participation à la mise en évidence d'un virus de type herpès chez les larves de Crassostrea gigas Au cours de l'été 1991, des mortalités anormales ont été observées en écloserie, chez des larves d'huître creuse, Crassas/rea gigas. L'examen en histologie classique et en microscopie électronique à transmission des échantillons de larves malades a permis de déceler la présence de lésions associées à des particules virales. La taille, la morphologie et la localisation de ces particules laissent penser qu'elles sont apparentées à la famille des Herpesviridae (Nicolas e/ al., 1992). Depuis cette première description, des épisodes de mortalités importantes (95-100%) en élevage larvaire de C. gigas, ont été relevés chaque année dans plusieurs écloseries privées françaises. Les échantillons analysés régulièrement à l'Unité de Recherche en Pathologie et Immunologie Générales (URPIG, station IFREMER de La Tremblade), ont permis de détecter à nouveau la présence de particules virales de type herpès dans les lots de larves présentant de fortes mortalités. Dans la plupart des cas, les larves cessent de se nourrir et de nager et des mortalités significatives sont observées à partir du sixième jour après la ponte. 100% de mortalité sont généralement atteints entre le huitième et le dixième jour après la ponte. Toutefois, dans certains élevages, 100% de mortalité sont atteints dès le quatrième jour, suggérant ainsi une infection très précoce des larves après la ponte ou même une transmission parentale du virus. Les larves présentent d'importantes lésions du vélum, celui-ci apparaît nécrosé sur un grand nombre d'individus et des cellules hypertrophiées, se détachant de l'animal, peuvent être observées. Très rapidement après le début des mortalités, les élevages présentent de nombreuses coquilles vides. L'examen en histologie classique des échantillons de larves d'huître creuse, C. gigas, en provenance d'écloseries privées a été effectué après fixation des échantillons par le liquide de Bouin, déshydratation, imprégnation et inclusion dans la paraffine. Des coupes histologiques de deux à trois micromètres d'épaisseur ont été réalisées, puis colorées à l'hémalun-éosine ou par la méthode de Feulgen et Rossenbeck. L'analyse en microscopie électronique à transmission des prélèvements de larves de C. gigas, a été réalisée après fixation par du glutaraldéhyde 3% en tampon cacodylate, postfixation à l'acide osmique 1 %, décalcification, déshydratation, imprégnation et inclusion en 62
ésine Epon. Des coupes semi-fines (1 Ilm), colorées au bleu de toluidine ont été observées au microscope photonique. Des coupes ultrafines (80 à 100 nm) ont également été réalisées, contrastées à l'acétate d'uranyle et au citrate de plomb, puis observées à l'aide d'un microscope électronique à transmission JEOL, JEM 1200 EX à 60 kVolts. L'ensemble de ces protocoles est détaillé en annexe 2. D'importantes lésions sont observées sur coupes histologiques et coupes semi-fines chez les larves malades. Ces lésions sont principalement localisées au niveau du tissu conjonctif (cellules de type fibroblastique) et, plus rarement, à l'épithélium du vélum et du manteau. Elles correspondent à la présence de cellules possédant une basophilie marquée, et sont associées à des images de nécrose dans le cas d'infections importantes (Figure 1). Ce tropisme apparent du virus pour les cellules de type fibroblastique est un des aspects biologiques caractéristiques de la sous famille des Betaherpesvirinae (Matthews, 1982). Cette particularité a également été décrite par Hine et al. (1992) lors de mortalités larvaires de C. gigas en Nouvelle-Zélande, associées à la présence d'un virus de type herpès. En microscopie électronique, les cellules hyperbasophiles du tissu conjonctif et du vélum présentent un noyau hypertrophié à nucléoplasme dense aux électrons et possèdent une chromatine rejetée en périphérie, contre la membrane nucléaire. Par ailleurs, leur cytoplasme est souvent réduit à une simple frange péri nucléaire. Ces cellules contiennent des particules virales en position intranucléaire et intracytoplasmique. Des virions sont également observés en position extracellulaire (Figures 2 et 3). Les particules virales intranucléaires sont circulaires, ovoïdes ou polygonales, de 72 à 75 nm de diamètre. Certaines de ces particules apparaissent vides et sont interprétées comme des capsides. D'autres contiennent un nucléoïde dense aux électrons de forme variable (toroïdale à parallélépipédique), de 45 à 50 nm en taille et correspondent à des nucléocapsides (Figure 4). Les capsides, qu'elles soient vides ou pleines, sont le plus souvent disséminées de façon irrégulière dans le nucléoplasme, mais elles peuvent aussi être observées en plage (Figure 5). Des virions enveloppés sont également parfois visibles en position intranucléaire, à l'intérieur d'inclusions limitées par une membrane (Figure 5). Ces images peuvent être interprétées comme des virions inclus dans des invaginations de la membrane interne du noyau. Les particules intracytoplasmiques, de forme arrondie, mesurent en moyenne 105 nm et possèdent une enveloppe constituée d'une membrane unitaire trilamellaire. Elles contiennent des structures identiques en forme et en taille aux capsides observées dans les noyaux des cellules infectées. Des virions non enveloppés peuvent également être visibles dans le cytoplasme. Il semble toutefois que dans ce cas, les particules virales aient été libérées dans le cytoplasme par rupture de la membrane nucléaire (Figure 6). Les virions en position extracellulaire sont enveloppés (Figure 7). Ils peuvent présenter des projections à la surface de l'enveloppe (Figure 8). De fins fibrilles sont également visibles dans l'espace clair, entre le nucléoïde et la face interne de la capside (Figure 8). Parfois, ces particules possèdent une queue (Figure 9). 63
Page 1 and 2:
1 1 1 1 Année 1995 UNIVERSITE DE B
Page 3 and 4:
à mes parents à Stéphane
Page 5 and 6:
1 1 ) TABLE DES MATIERES INTRODUCTI
Page 7 and 8:
3 - Essais d'infection expérimenta
Page 9 and 10:
INTRODUCTION
Page 11 and 12:
d'approche pour contrôler les mala
Page 13 and 14:
1 1 1 1 1 1 1 1 j Un premier chapit
Page 15 and 16:
DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES 1 - Rappel
Page 17 and 18:
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Page 19 and 20:
et Wray, 1952 ; Mackin, 1962 ; Burr
Page 21 and 22: 1 1 1 1 1 1 1 1 des zones indemnes
Page 23 and 24: 3 - Procaryotes Les mollusques biva
Page 25 and 26: Tableau 4 : Infections à Chlamydie
Page 27 and 28: cheptels de C. angulala, a conduit
Page 29 and 30: t t 1 1 1 1 t 1 1 t 1 1 t 1 1 t 1 1
Page 31 and 32: i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 J 1 int
Page 33 and 34: 1 1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 1
Page 35 and 36: III - Caractéristiques principales
Page 38: 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 J 3.2 - Entr
Page 41 and 42: 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Page 43 and 44: i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 J 1 int
Page 45 and 46: 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 PREAMBULE Pub
Page 47 and 48: Chapitre 1 : Caractérisation d'un
Page 49 and 50: l 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 PUBLICATI
Page 52 and 53: References AllIle . w .. SchlOl fc
Page 55 and 56: Platichtys flesus, plie, Pleuronect
Page 57: Figure 1 : Marquage de coupes de do
Page 60 and 61: CHAPITRE 2 Comparaison antigénique
Page 62 and 63: Ces électrophorèses ont égalemen
Page 64 and 65: 1\6 , HMW LMW Figure 1 : Caractéri
Page 66 and 67: a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 --- - - - - Il
Page 68 and 69: Tableau 2 : Comparaison anti géniq
Page 70 and 71: Figure 4 : Coupe histologique d'hû
Page 74 and 75: Les virions observés chez les larv
Page 76: • •• Figure 2 : Cliché en mi
Page 81 and 82: 2 - Participation à la mise en év
Page 83 and 84: Figure 10 : Lésions histologiques
Page 85: Bu ll. Eur. Ass. Fi sh Palhal.. 14(
Page 89: 736 Material and methods Samples of
Page 93 and 94: 740 RENAULT (T.) ET COLLABORATEURS
Page 95 and 96: 742 15. - MURP HY (F.A.) and K INGS
Page 97: Chapitre Il : Essais de reproductio
Page 103 and 104: 2 - Essais d'infection expérimenta
Page 107 and 108: CHAPITRE 3 Effet de la température
Page 109 and 110: 26°C), de détecter la présence d
Page 111 and 112: présentent des lésions histologiq
Page 113: Introduction The Pacific oyster, 'C
Page 117 and 118: (Table 1). 100% mortality in this g
Page 119 and 120: than at high temperature (25-26°C)
Page 121 and 122: Our plans for testing this la st hy
Page 123:
LEGEND TO FIGURES Figure 1 : Origin
Page 129 and 130:
CHAPITRE IV : Essais de propagation
Page 132 and 133:
Figure 1 : Principales caractérist
Page 135 and 136:
2 - Essais d'infection de primocult
Page 137 and 138:
(SVF) et/ou d'hémolymphe de Crassa
Page 139:
68 0.2 g/I, KCI, No. P 1300' 2.77 g
Page 143 and 144:
72 2. Cousserans F, Bonami lR, Comp
Page 145 and 146:
2.2. Essais d'infection de primocul
Page 147 and 148:
Chapitre V : Mise au point d'un pro
Page 149 and 150:
Du fait de la présence d'une coqui
Page 151:
• " (1 - " 100nm 100nm Figures 1
Page 154 and 155:
Chapitre VI : Mise au point de mét
Page 156 and 157:
chromatine est rejetée en périph
Page 159 and 160:
528 RM Le DeuN et al ,GD Fig 2. Imm
Page 161 and 162:
1.2 - Recherche de séquences conse
Page 163 and 164:
DJBE16 DJBE2L DJBECI DJBE16 DJBE2L
Page 165 and 166:
1.2.2 - Alignement des séquences D
Page 167 and 168:
viral, des spots d'intensité plus
Page 169 and 170:
visualisées sur les dépôts d'ADN
Page 172:
Figure 6 : Diagnostic de l'infectio
Page 175 and 176:
CONCLUSION L'ensemble de ce travail
Page 177 and 178:
séquences disponibles dans les ban
Page 179 and 180:
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Ahne W.
Page 181 and 182:
Cahour A., 1979. Mar/eilia refringe
Page 183 and 184:
Darlington R.W. et Moss L.H., 1969.
Page 185 and 186:
Girard M. et Hirth L., 1989b. Méth
Page 187 and 188:
Johnson D.C. et Spear P.G., 1982. M
Page 189 and 190:
Lemaster S. et Roizman B., 1980. He
Page 191 and 192:
Ohba M., Kanda K. et Aizawa K., 199
Page 193 and 194:
Read G.S. et Frenkel N., 1978. Herp
Page 195:
Shuster C.L. et Hillman T.E., 1963.
Page 200 and 201:
1994 : P. Maffart, R.M. Le Deuff, T
Page 203:
days, according to Reed and Muench'
Page 206 and 207:
detect a single infected cell in a
Page 211 and 212:
Vet Res (1995) 26. 539·543 © Else
Page 216 and 217:
Annexe 2 : Méthodes et techniques
Page 218 and 219:
minutes, puis les coupes sont réhy
Page 220 and 221:
2.1 - Préparation des solutions -
Page 223:
2.6 - Coloration négative Lors des
Page 226:
Gel de concentration 4% H 20 Tampon
Page 229 and 230:
le tampon de transfert et superpos
Page 231:
NaCI NaN) Ajuster le pH à 7 Tampon
Page 235:
Epuisement des anticorps 1 - Utilis
Page 238 and 239:
6 - Prélever la phase supérieure
Page 241:
Tris-HCl pH8 1 ml Préparer extempo
Page 245:
2 - Prélever 1 ml de tampon d'hybr
show all

Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?