Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

Gel de concentration 4%
H 20
Tampon pour gel de concentration
Acrylamide 30%
Bisacrylamide 1 %
Persulfate de NH 4
Temed
4,9 ml
2,5 ml
1,3 ml
1,3 ml
40 III
20 III
Ces solutions sont préparés extemporanément et mélangées doucement sans faire de
bulles.
Les gradients sont préparés en utilisant un volume de solution lourde et trois volumes
de la solution légère choisie. Le mélange des deux solutions est réalisé à l'aide d'un formeur
de gradient. Ce dernier permet d'additionner et de mélanger de façon régulière la solution
légère (moins concentrée) à la solution lourde (plus concentrée). Dans le même temps, le
mélange est coulé entre deux plaques de verre, dans un espace de 1 mm d'épaisseur. Deux
gradients de concentration sont obtenus de cette façon, ils concernent le glycérol et
l'acrylamide. Le gradient de concentration de glycérol est un gradient de densité qui permet,
lors du coulage du gel, de conserver un gradient de concentration d'acrylamide continu et
régulier. Le gradient obtenu présente une concentration en acrylamide de 17,5% en bas du gel,
cette concentration diminue de façon régulière jusqu'en haut du gradient, où elle est de 4% ou
7,5%, selon la composition de la solution légère utilisée.
Après avoir coulé le gradient entre les plaques de verre, de l'eau est versée doucement
à la surface" de façon à l'aplanir, et éviter que le gel ne sèche lors de la polymérisation.
Après polymérisation (30 à 60 min), l'eau en surface du gel est éliminée, et le gel de
concentration est coulé jusqu'en haut des plaques de verre et un peigne est inséré, de façon à
former des puits pour le dépôt des échantillons. Après une demi heure, le gel de concentration
a polymérisé et le peigne peut être ôté.
Le gel est alors placé dans une cuve contenant du tampon d'électrophorèse cette cuve
comporte deux compartiments: le compartiment inférieur, dans lequel baigne le bas du gel, et
le compartiment supérieur, dans lequel baigne le haut du gel et les puits. Les échantillons
dénaturés sont déposés dans les puits. Quelques gouttes de bleu de bromophénol 0,1% sont
additionnés au tampon contenu dans le compartiment supérieur de la cuve, afin de pouvoir
visualiser un front de migration pendant l'électrophorèse.
Une tension constante de 25 mA est appliquée, le haut et le bas du gel correspondant
respectivement à la cathode et à l'anode. De cette façon les protéines, saturées en SDS et
présentant une charge globale négative, migrent vers le bas du gel et sont séparées le long du
gradient en fonction de leur taille. L'électrophorèse est poursuivie jusqu'à ce que le front de
migration (bleu de bromophénol) sorte du gel (lh à Ih30).
Coloration à l'argent
Réactifs
Premier liquide de fixation
Ethanol absolu 40%
Acide acétique glacial 10%
Deuxième liquide de fixation
215