Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

Tris-HCl pH8 1 ml
Préparer extemporanément
TE-RNase
Tris-HCl pH 8 10 mM
EDTA 1 mM
RNase 20 Ilg/1l1
Préparer à partir d'un stock de RNase à 10 mg/ml, conservé à -20°C.
Acétate de Na 3M
Isopropanol
Ethanol 70%
Méthode
1 - Ensemencer une colonie de la souche bactérienne dans 3 ml de SOB contenant de
l'arnpicilline, et agiter 15-20h à 37°C.
2 - Centrifuger 1,5 ml de culture (12 000 g, 30 secondes) et éliminer le surnageant.
3 - Ajouter 400 III de STET, puis 30 III de lysozyme et vortexer. Incuber à 4°C, 30
secondes à 10 minutes.
4 - Lyser en plaçant les tubes dans un bain-marie bouillant 1 à 2 minutes, puis laisser
refroidir 5 minutes.
5 - Centrifuger (12 OOOg, 10 à 30 minutes). Le culot, contient les débris bactériens et
l'ADN chromosomique, il est éliminé à l'aide d'un cure dents.
6 - Au surnageant contenant les plasmides, ajouter 40 III d'acétate de Na 3M et 500 III
d'isopropanol prérefroidi. Vortexer et laisser 5-30 minutes à -20°C.
7 - Centrifuger (12 OOOg, 5 min), éliminer le surnageant.
8 - Laver le culot d'ADN précipité par addition d'éthanol 70%, centrifuger (12 OOOg, 5
min) et éliminer le surnageant.
9 - Sécher le culot sous vide (5 min), ajouter 50 III de TE-RNase et vortexer
brièvement.
10 - Analyser les plasmides par digestion enzymatique et électrophorèse, puis stocker à
-20°C.
Maxipréparation de plasmides
Réactifs
Solution 1
Sucrose 25%
Tris-HCl pH 8 50 mM
EDTApH 8 5 mM
Contrôler le pH sans l'ajuster, il doit être supérieur ou égal à 8.
Solution II
Tris-HCl pH 8
EDTApH 8
Triton XIOO
Lysozyme (voir plus haut)
Chlorure de Césium (CsCI)
50 mM
5mM
5%
230