Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

conservés. De ce fait, un prélèvement trop tardif ne permet pas d'obtenir suffisamment de
matériel virosé.
L'ensemble des analyses de cas de mortalité de larves de C. gigas en écloserie,
effectuées en microscopie électronique, et leur comparaison avec les symptômes
macroscopiques (taux de mortalité, réduction de l'activité de nage, présence de coquilles
vides, nécrose du vélum) permettent toutefois d'estimer le moment où le prélèvement est
optimal.
Ainsi, ces observation montrent que les échantillons doivent être prélevés parmi les
larves ayant sédimenté dans les élevages (60 à 100% d'individus au fond des jarres). Parmi les
animaux ayant sédimenté, une proportion de 10 à 40% de coquilles vides et un aspect nécrosé
du vélum des individus morts et moribonds, reflète une infection virale avancée, pour laquelle
les tissus contiennent une grande quantité de particules virales.
Il est, en effet, nécessaire d'utiliser ces critères macroscopiques, afin de sélectionner
les animaux servant aux purifications, les contrôles en microscopie électronique étant
effectués a posteriori.
Des essais de purification ont été réalisés à partir d'échantillons frais ou congelés à _
20°C. Il semble qu'un meilleur rendement de purification soit obtenu lorsque les animaux sont
utilisés directement après le prélèvement, sans avoir été préalablement congelés. Une
conservation des échantillons de larves à 4°C et à sec semble toutefois possible, si la
purification est réalisée dans les trois jours après le prélèvement.
2 • Choix du tampon de purification.
Différents tampons ont été testés lors des essais de purification.
Des essais ont été réalisés en tampon TNE (Tris 10mM, NaCI 500mM, EDTA ImM,
pH 8) (Hayashi et al., 1986 ; Seal et St Jeor, 1988), additionné ou non de Tween 80 (0,5%)
(Hervio, 1992) et en eau de mer.
De meilleurs résultats ont été obtenus lorsque la purification est réalisée en eau de mer.
Celle ci est filtrée sur membrane de porosité 0,2 !-lm, puis autoclavée. L'eau de mer est filtrée
à nouveau sur 0,2 !-lm afin d'éliminer les cristaux de sels qui se sont formés lors de la
stérilisation et elle est additionnée d'un agent antiprotéasique, le PMSF (Phényl Méthyl
Sulfonyl Fluoridel, 100 !-II d'une solution stock à 10 !-Ig/ml pour 200 ml d'eau de mer filtrée).
3 • Mise au point d'une méthode de broyage des tissus virosés.
La première étape du protocole de purification des particules virales est le broyage des
tissus virosés. Celui-ci est essentiel au bon déroulement des étapes suivantes car il doit
permettre non seulement de dissocier les tissus, mais aussi de lyser les cellules ainsi que leurs
noyaux. De plus, le volume de tampon dans lequel les tissus sont broyés doit être suffisant
pour ne pas perdre les particules virales lors des étapes suivantes de filtration et de
clarification des broyats.
Les naissains d'huîtres sont aisément broyés à l'aide d'un homogénéiseur de tissus de
type Ultra-Turrax, dont les performances sont bien adaptées à la dissociation tissulaire et
cellulaire (Mialhe et al., 1988). Un broyage optimal est obtenu de cette façon lorsqu'un
vol ume minimal de 15 ml de tampon est utilisé par gramme de tissus virosés.
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