Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

3 - Monter sous lamelle avec une goutte de résine Eukitt, avant d'observer au
microscope photonique.
4.5 - Immunogold
Réactifs
PBS : voir paragraphe 4.3.
Lait écrémé en poudre (Régilait)
Métapériodate de sodium, 4% en eau distillée, préparé extemporanément.
Acétate d' uranyle : vo ir paragraphe 2.5 .
Méthode
1 - Des coupes ultrafines sont réalisées comme décrit au paragraphe 2.5, mais elles
sont recueillies sur des grilles de nickel (le cuivre fixe les billes d'or).
2 - Réhydrater les coupes en les faisant passer délicatement dans une goutte d'eau (30
passages).
3 - Démasquer les antigènes par un bain de dix minutes en métapériodate de sodium
4%.
4 - Laver dans deux gouttes d'eau distillée (voir étape 2).
5 - Saturer 10 minutes en PBS additionné de Régilait (\ %)
6 - Incuber trois à quatre heures en présence du premier anticorps dilué en PBS.
7 - Rincer par six gouttes de PBS (voir étape 2).
A partir de l'étape 8, les grilles sont manipulées avec des pinces en plastique, qui ne
fixent pas les billes d'or.
8 - Incuber une heures à l'obscurité, en présence du second anticorps conjugué avec
des billes d'or, dilué 1/25° en PBS.
9 - Rincer par cinq gouttes de PBS (voir étape 2).
\0 - Sécher 10 minutes à 37°C, puis contraster les coupes à l'acétate d' uranyle (voir
paragraphe 2.5).
II - Sécher dix minutes à 37°C et observer au microscope électronique à transmission.
4.6 - Préparation de poudre acétonique et épuisement des anticorps polyclonaux
Les anticorps polyclonaux, sous forme de sérum ou d'ascite, peuvent être épuisés
avant leur utilisation dans différentes méthodes immunologiques. L'épuisement a pour but
d' éliminer les anticorps non spécifiques. De cette façon, la spécificité du sérum est accrue.
Préparation de la poudre acétoniQue
1 - Placer les tissus dans un cylindre de Potter
2 - Ajouter 20 ml d'acétone
3 - Broyer intensément à l'aide d'un homogénéiseur de tissus de type Ultra-Turrax,
puis à l'aide du piston du tube de Potter.
4 - Centrifuger (3000g, 30 min) et éliminer l'acétone.
5 - Renouveler les étapes 2 à 4, deux ou trois fois, jusqu'à obtention d'un surnageant
(acétone) limpide.
6 - Laisser sécher le culot à l'air.
7 - Ecraser finement la poudre acétonique.
8 - Conserver à 4°C.
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