Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

NaOH3M
Acétate d'ammonium lM et 2M, pH7
Hyperfilm ECL (Amersham), de haute résolution pour la luminescence
Révélateur radiographique (Kodak)
Fixateur radiographique (Kodak)
Préparation des blots
1 - Diluer l'ADN à déposer en solution aqueuse (TE) dans un volume de 90 Ill.
Dénaturer par addition de 0,1 volume (9 Ill) de NaOH (3M), et incubation Ih à 60-
70°C.
2 - Neutraliser par addition de un volume (l00 Ill) d'acétate d'ammonium (2M).
3 - Diluer en série au 1/10° avec de l'acétate d'ammonium 1 M.
4 - Prémouiller une membrane de nylon (Hybond N+, Amersham) avec de l'eau
distillée, puis du SSC 20X. Déposer l'ADN sur cette membrane sous forme de spots de
3 mm de diamètre, à l'aide d'un manifold : déposer un volume de 200 III par puits,
après complète filtration, rincer les puits par 200 III de SSC20X.
5 - Déposer la membrane sur une feuille de papier buvard (Whattman 3MM). Fixer
l'ADN sur la membrane en la plaçant 2h à 80°C. Celle ci peut alors être conservée à
4°C, enveloppée dans un film Saran Vrap.
Préparation des sondes
1 - Digérer 5 Ilg de plasmide par l'enzyme de restriction adéquate, déposer le produit
de cette réaction sur un gel d' agarose.
2 - Après électrophorèse, découper sur le gel la bande d'agarose contenant l'ADN qui
correspond à la sonde (par exemple, un fragment d'ADN viral).
3 - Découper finement l'agarose à l'aide d'une lame de scalpel et placer les morceaux
dans un microtube contenant 1 ml de TE. Laisser diffuser à température ambiante
pendant 15h.
4 - Centrifuger pour éliminer l'agarose (8000g, 10 min, 4°C). Eliminer le BrEt par de
l'isobutanol (voir paragraphe 6.2), l'utilisation d'isobutanol non saturé en eau permet
de réduire le volume de la phase aqueuse.
5 - Précipiter la sonde par addition d'acétate de sodium 3M (1/10 volume), de
glycogène (3111) et d'alcool absolu (2 volumes). Placer à -80°C, deux heures.
Centrifuger et rincer à l'éthanol 70%, comme décrit précédemment. Resuspendre dans
de l'eau distillée.
6 - Contrôler la qualité et la quantité d'ADN par électrophorèse. Ajuster la
concentration de la sonde à 10-20 ng/Ill.
7 - Dénaturer 10 III (100-200 ng) de sonde en plaçant le tube au bain-marie bouillant
(5 min), puis sur glace (5 min ou plus). Centrifuger 10 secondes.
8 - Marquer selon les indications du fournisseur du kit : ajouter un volume (10 Ill) de
réactif 1 (peroxydase) et bien mélanger, ajouter un volume de réactif 2
(glutaraldéhyde), vortexer et placer 10 minutes à 37°C.
9 - Conserver 10 à 15 minutes sur glace ou à -20°C, en présence de glycérol (50%).
Hybridation. layal:es et révélation
1 - Préhybrider (30 à 60 min, 42°C) dans le tampon fourni avec le kit de marquage,
additionné de NaCl (0,5M) et du réactif de saturation fourni (5%). Un volume de 0,125
à 0,25 mllcm 2 est utilisé.
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