Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

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PUBLICATION 8 Methods in Cell Science 17 : 199-205, 1995 Isolation and culture of heart ce Us from the European fiat oyster, Ostrea edulis Tristan Renault, Géraldine Flaujac & Rose-Marie Le Deuff IFREMER, Laboratoire de Génétique, Aquaculture et Pathologie, Unité de Recherche en Pathologie et Immunologie Générales, La Tremblade, France Accepted in revised from 13 June 1995 Abstract : The present study reports a culture technique for heart tissues of the European fiat oyster, Ostrea edulis. Heart tissues of fiat oysters were dissociated by a trypsin-EDTA treatment and a mechanical action in a Dounce-type homogeneizer. Then, dissociated cells were cultured in three different synthetic media, in pure sea water or in sea water mixed with sterile filtered Japanese oyster, Crassostrea gigas, hemolymph. AI! these media were supplemented with 10% of fetal bovine serum. Cultures were grown at 20· C in previously Poly-DLysin coated flasks or culture wells. The optimized medium, 3% L 15 medium (w/v) in sterile sea water mixed with Japanese oyster hemolymph (1 :1) and supplemented with 10% offetal bovine serum gave the best result. Morphological characterization for the cardiac cultured cells was performed. Thus, cell monolayers of dissociated heart tissues consisted essential!y of hemocytes and large granular pigmented cells. Key words : Bivalve, Cell culture, European fiat oyster (Ostrea edulis), Heart Page 131 à Page 137
2.2. Essais d'infection de primocultures de cellules cardiaques de Crassostrea gigas Des monocouches confiuentes de cellules cardiaques de C. gigas ont été inoculées par des broyats de larves de C. gigas saines et vi rosées comme décrit dans le paragraphe l.l, à l'exception des broyats qui sont réalisés ici en eau de mer. Puis les fioles sont placées à 20°C. Les températures d' incubation supérieures testées ne permettent pas une survie suffisante des cellules. Un effet cytopathogène discret, mais spécifique dans les fioles ayant reçu un inoculum virosé est visible après 48 heures, mais disparaît totalement 5 à 6 jours post infection. Les anomalies se manifestent par un allongement des cellules de type fibroblastique dans les fioles ayant reçu un broyat de larves virosées non dilué ou dilué au III 0 (Résultat non montré). Les tapis de cellules inoculés par des broyats de larves vi rosées dilués 1/100 ou de broyats de larves saines ne présentent pas ces effets. L'analyse en microscopie photonique, de cellules cytocentrifugées, puis colorées à l'hémalun éosine ou par la méthode de Feulgen et Rossenbeck, révèle la présence de noyaux légèrement plus gros dans certaines cellules sur les préparations cytocentrifugées, préparées à partir des cultures vi rosées. Toutefois, ces lésions histologiques n'ont pas pu être corrélées à des lésions ultrastructurales, en microscopie électroniques. Tout comme dans le cas des cellules BF2, cet effet cytopathogène du virus de type herpès sur les primocultures de cellules de C. gigas pourrait être interprété comme le résultat d'un cycle viral abortif. Toutefois, l'effet cytopathogène n'est observé qu'après inoculation de broyats vi rosés purs et dilués au 1/10, et disparaît lorsque le broyat inoculé est dilué au 1/100. Il est donc probable que les broyats obtenus à partir de larves virosées contiennent des substances toxiques pour les cellules. Cependant, ces substances toxiques pourraient être les protéines virales elles mêmes. 138
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