Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

cellules se fixent en plus grand nombre s'étalent et semblent pousser. Elles se conservent
environ huit jours. D'autre part, en eau de mer filtrée, les cellules assez nombreuses, s'étalent
bien au bout de trois jours et dans ce milieu, elles subsistent plus longtemps en bon état (plus
de huit jours).
Des tests répétés confirmant ces résultats, il semble que l'eau de mer soit un bon milieu
de conservation des cellules mais ne contenant que très peu d'éléments nutritifs, alors que le
milieu LIS (3X) assure une moins bonne conservation des cellules mais contient des éléments
nutritifs. Il a donc été testé, en fonction de ces observations, des mélanges de milieu LIS (3X)
et d'eau de mer filtrée stérile.
Pour les fioles contenant des mélanges de ratio 3:2 et 2:3, les résultats obtenus au bout
de dix jours tendent à prouver que les deux milieux sont complémentaires. En effet, les
cellules s'étalent au bout de trois jours, des foyers de cellules de type fibroblastique
apparaissent, les cellules s'étalent et ne meurent qu'au bout d'une dizaine de jours. Il reste
encore des cellules fixées au bout de 15 jours de culture. Pour des mélanges de ratio 1:4 et
4: l, les résultats sont comparables à ceux des tests avec les milieux purs.
Ces essais de primoculture sont répétés avec des quantités de cellules croissantes, pour
essayer d'obtenir un tapis cellulaire confluent. Les premiers essais étaient réalisés en inoculant
les cellules provenant de 1,7 ventricules par fiole de 25 cm 2 . De meilleurs résultats, en termes
de croissance cellulaire, ont été obtenus lorsque les cellules provenant de 3,5 ventricules
étaient inoculés par fiole de 25 cm 2 .
En effet, un grand nombre de cellules meurent lors des deux premiers jours. Il est donc
nécessaire de réaliser un inoculum de départ suffisant dans les fioles de culture. Un nombre
important de cellules ancrées au fond des fioles produit un micro environnement qui favorise
la croissance cellulaire (Gumbiner el al., 1993 ; Watson el al., 1987). En effet, certaines
cellules sécréteraient dans le milieu de culture, des substances nécessaires au développement
d'autres types cellulaires. Un tel phénomène de coopération cellulaire nécessite qu'un plus
grand nombre de cellules soient ensemencées dans les fioles.
De plus, afin de favoriser la fixation des cellules dans les fioles de culture, des tests ont
été réalisés en prétraitant ces fioles par la poly-D-lysine. Dans les premiers jours de culture, la
différence entre les fioles témoin et les fioles traitées à la poly-D-lysine, n'est pas visible. Par
contre au bout de six à sept jours, les cellules des fioles témoins se décrochent et les cellules
restées fixées présentent un état de conservation médiocre par rapport aux cellules dans les
fioles traitées à la poly-D-lysine.
L'environnement extracellulaire est d'une grande importance puisqu'il influence le
métabolisme cellulaire et la structure du cytosquellette, donc également la morphologie des
cellules in vivo et in vitro (Alberts el al., 1983). D'autre part, le traitement des fioles à la poly­
D-lysine favorise l'ancrage des cellules, ce qui est un facteur nécessaire à la division de
nombreux types de cellules (Watson el al., 1987).
En plus des conditions décrites précédemment, les milieux de culture contenus dans
les fioles sont éliminés chaque jour, les tapis cellulaires sont rincés et le milieu est renouvelé
régulièrement. Cette opération permet l'élimination des cellules mortes, non fixées, dont la
dégradation peut entraîner la libération de produits toxiques.
En dernier lieu, en supposant la présence de facteurs de croissance et d'éléments
nutritifs dans l'hémolymphe des huîtres (Sevala, 1993), des milieux de culture, L-15(3X):eau
de mer (1: 1), supplémentés par différentes quantités (l,Sou 10%) de sérum de veau foetal
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