Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

2.6 - Coloration négative
Lors des essais de purification de virus, le contrôle des différentes étapes peut être
réalisé par la méthode de coloration négative.
Des grilles de cuivre collodionnées sont mises à flotter sur une goutte d'albumine
(0,1% en eau distillée, 2 min), puis sur une goutte de la suspension à contrôler (5 min). Le
prétraitement à l'albumine favorise l'adsorption ultérieure des particules (virus par exemple)
sur la pellicule de collodion.
Les particules adsorbées sur les grilles sont fixées 10 min en glutaraldéhyde 1 %, celle
ci est préparée dans le même tampon que la suspension à analyser, c'est à dire en tampon TNE
(voir chapitre Il, première partie) pour les purifications de LDV, en eau de mer pour les
purifications de virus de type herpès.
Un contraste négatif des particules est réalisé par incubation des grilles (deux fois 45
sec) dans une solution d'acide phosphotungstique (PTA, 2%), puis les grilles sont séchées 20
minutes à 37°C avant d'être observées au microscope électronique.
3 - Méthodes d'étude des protéines
3.1 - Electrophorèse des protéines en gel SDS-PAGE
Préparation des échantillons
Réactifs
Tampon de lyse
Tris-HCI pH 8
NaCI
NaN 3
Triton XIOO
50mM
150mM
0,02%
1%
Ajouter extemporanément des antiprotéases :
Phénylméthylsulfonylfluoridel (PMSF) : une solution stock (10 mg/ml) conservée à -
20°C, préparée en DMSO (diméthylsulfoxyde). Ajouter 100 Ill/IO ml, soit 100 Ilg/ml
en concentration finale.
Aprotinine : une solution stock (10 mg/ml) conservée à -20°C est préparée en eau
distillée. Ajouter 1 Ill/ IO ml, soit 1 Ilg/ml en concentration finale.
Solution A pour le dosage des protéines
Mélanger extemporanément :
19,6 ml d'une solution stock de Na2C03 (2g Na2C03 ; 0,4g NaOH; 100 ml H20)
0,2 ml d'une solution stock de CUS04 (lg CUS04, 100 ml H20)
0,2 ml d'une solution stock de tartrate de sodium et de potassium (2g tartrate de Na et
K, 100 ml H20, conserver à -20°C)
Solution B pour le dosage des protéines
Mélanger extemporanément:
1 ml de réactif phénolique de Folin-Ciocalteu (Sigma)
1 ml eau distillée
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