Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

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minutes, puis les coupes sont réhydratées par un bain d'eau courante pendant dix minutes. Différentes colorations topographiques ou histochimiques peuvent alors être réalisées. Coloration topograp"ique à /'''éma/un-éosine L 'hémalun permet de colorer les structures nucléaires ou basophiles en bleu à violet foncé, les ergastoplasmes sont bleus et les cytoplasmes prennent une teinte grise. La coloration des autres structures en rose est réalisée par un colorant acide, l'éosine. La mise en oeuvre de cette coloration est simple et reproductible. Cette technique ne permet qu'une différentiation limitée des structures. Toutefois, elle permet d'observer les tissus au microscope photonique et de noter les éventuelles anomalies dans les structures tissulaires et cellulaires. Préparation des réacti fs Hémalun : Hématoxyline 4 g Alcool à 95° 200 ml Potassium aluminium sulfate Il g Eau distillée 200 ml Glycérol 200 ml Acide acétique 20 ml Iodate de potassium 0,8 g (ou KMnO : 4,07 g) Dissoudre l'hématoxyline dans l'alcool. Dissoudre l'alun de potassium dans l'eau distillée. Mélanger les deux solutions et ajouter les autres constituants dans l'ordre énuméré. Eosine: Eosine Eau courante Coloration des coupes réhydratées: Hémalun Rincer à l'eau courante Eosine Rincer à l'eau courante Ethanol absolu 2,5 g 250 ml 1 à 2 min 3 minutes 3 min 1 min 3 bains de 3 min Xylène 2 bains de 10 min Monter sous lamelle avec une goutte de résine Eukitt Coloration nuc/éa/e de Feulgen et Rossenbeck Cette coloration est basée sur la mise en évidence des fonctions aldéhydes libérées par hydrolyse acide des sucres contenus dans les acides nucléiques de type ADN. Cette technique est utilisée afin de préciser la nature des structures basophiles pouvant être observées après colorations à l'hémalun-éosine. De ce fait, cette méthode est particulièrement indiquée pour détecter la présence d'agents viraux ou bactériens de taille inférieure au pouvoir de résolution du microscope photonique. Leur accumulation dans les cellules peut alors être visualisée sous la forme de corpuscules contenant de l'ADN. Une coloration rouge à rose des aldéhydes et de l'ADN hydrolysé est observée. 207
Coloration des coupes réhydratées; Hydrolyse acide par l'HCl 1 N à 60°C Rincer à l'eau courante Rincer à l'eau distillée Réactif de Schiff (Merck) Rincer à l'eau courante Ethanol absolu 6 min S min 1 min 60 min 10 min 3 bains de 2 min Xylène 2 bains de 10 min Monter les lames sous lamelle avec une goutte de résine Eukitt Coloration à l'acridine orange L'acridine orange se fixe sur les molécules et structures basophiles, elle pennet en particulier de visualiser la présence d'ARN et d'ADN. Au microscope à épifluorescence, ce colorant métachromatique peut donner lieu à une fluorescence verte ou rouge, qui reflète différents états de l'acridine orange. Ainsi, lorsque celle ci est fixée sur un acide nucléique (ADN ou ARN) double brin, la fluorescence observée est verte. Lorsque l'acridine orange est fixée sur un acide nucléique simple brin, elle fluoresce en rouge. Préparation des réacti fs ; Solution d'acide citrique MIlO Solution de phosphate disodique MIS 21,01 g/l 28,39 g/l Tampon de Mac Ilvaine, pH 4 ; Acide citrique MIlO 122,9 ml Phosphate di sodique MIS 77,1 ml Préparer extemporanément à partir des solutions stocks. Solution stock d'acridine orange 0,1 % Préparer en tampon de Mac Ilvaine pH4. Conserver à l'abri de la lumière, à 4°C. Coloration des coypes réhydratées; Colorer avec la solution stock d'acridine orange diluée au 1/10 en tampon de Mac Ilvaine pH4 10 min Rincer en tampon de Mac Ilvaine pH4 2 fois 10 min Monter sous lamelle, avec une goutte de tampon glycériné et lutter au vernis à ongles. L'observation des coupes est réalisée sous un microscope à épi fluorescence. 2 - Méthodes de microscopie électronique La préparation des échantillons pour la microscopie électronique comporte plusieurs étapes; - Fixation des tissus - Décalcification éventuelle des échantillons 208
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