Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

Coloration
Cette étape est réalisée en deux temps. Au cours d'un premier bain, le nitrate d'argent
se fixe sur les protéines, puis le nitrate d'argent est précipité par la solution de révélation,
permettant de visualiser des bandes marron, correspondant aux protéines séparées sur le gel.
- Nitrate d'argent 0,4% préchauffé à 37°C, un bain de 13 minutes.
- Rinçage en eau distillée, trois fois 30 secondes
- Solution de révélation, un bain de 30 secondes, puis un bain de 4 à 10 minutes, dans
la pénombre
- Lorsque la coloration est jugée suffisante, deux bains de quatre minutes dans la
solution d'arrêt
Le gel coloré est alors placé dans une solution de glycérol 10%, qui lui confere une
certaine rigidité et facilite sa manipulation ultérieure.
3.2 - Détection des glycoprotéines
Transfert des protéines sur membrane
Les protéines séparées par électrophorèse en gel SOS-PAGE sont transférées sur
membrane à l'aide d'un appareil de transfert semi-sec (Novablot, LKB).
Réactifs
Tampon de transfert
Glycine
Tris
SOS
Méthanol
39mM
48 mM
0,035%
20%
Transfert
Le transfert des protéines est réalisé par électrophorèse entre deux plaques de graphite
constituant l'anode et la cathode. La conduction du courant est assurée par l'intermédiaire de
feuilles de papier filtre imbibées de tampon de transfert. Les protéines sont électroéluées du
gel SOS-PAGE lorsque une tension lui est appliquée. Les protéines éluées sont alors retenues
par une membrane de nitrocellulose placée au contact du gel, du côté de l'anode.
De façon à obtenir un transfert optimal, il est important d'une part de ne pas piéger de
bulles d'air dans les feuilles de papier filtre et la membrane de nitrocellulose ou entre les
différentes couches de papier, membrane et gel. D'autre part, les feuilles de papier filtre et la
membrane de nitrocellulose sont découpées aux dimensions exactes du gel, diminuées d'un
millimètre. En effet, le gel se rétracte légèrement au contact du tampon de transfert et de cette
façon, tout les constituant superposés sont de dimensions identiques.
La plaque de graphite inférieure (anode) est prémouillée avec de l'eau distillée et
l'excès d'eau est épongé. Neuf feuilles de papier filtre imbibées de tampon de transfert sont
superposées exactement et précautionneusement, de façon à ne pas piéger de bulles d'air entre
les feuilles. Une membrane de nitrocellulose, est prémouillée avec de l'eau distillée, puis dans
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