Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

6 • Méthodes de biologie moléculaire
6.1 - Extraction d'ADN
Réactifs
Tampon de digestion
NaCI
Tris
EDTA
SDS
pH 8
100mM
10mM
2SmM
O,S%
ProtéinaseK
La protéinaseK est préparée à 10 mg/ml, en eau distillée, et stockée à -20°C.
EIIe est utilisée dans le tampon de digestion à 0,2 mg/ml.
Tampon TE
Tris
EDTA
pH 8
10mM
ImM
Chloroforme
Chloroforme 24 volumes
Alcool isoamylique 1 volume
Phénol tamponné à pH 8.
Azote liquide
Acétate d'ammonium 7,S M
Ethanol absolu
Ethanol à 70%
Extraction
1 - S'il s'agit d'huîtres adultes, les ouvrir et prélever le manteau qui est congelé
rapidement dans l'azote liquide et broyé au mixer. La poudre fine obtenue est mise en
suspension dans le tampon de digestion. Environ dix volumes de tampon de digestion
sont utilisés pour un volume d'huître pulvérisée. S'il reste des fragments de manteau
insuffisamment broyés, il est préférable de les éliminer par centrifugation (2000g, S
minutes, 4°C).
l' - S'il s'agit de larves, l'extraction d'ADN est réalisée en broyant ces dernières à
l'aide d'un homogénéiseur de tissus de type Ultra-Turrax, en présence de tampon de
digestion ne contenant pas de SDS. Le broyat est alors dilué par addition d'un volume
de tampon de digestion contenant 1 % de SDS.
1"- L'extraction d'ADN à partir de culots de particules virales purifiées est réalisée en
broyant le culot à l'aide d'un tube de Potter, en présence de tampon de digestion.
2 - Ajouter 0,2 mg/ml de protéinaseK et incuber 3h à SO-S6°C.
3 - Ajouter à nouveau 0,2 mg/ml de protéinaseK et incuber 1 Sh à SO-S6°C.
4 - Extraire les protéines par addition d'un volume de phénol, puis mélanger et ajouter
un vol ume de chloroforme. Centrifuger (10 OOOg, 20 min, 4°C).
S - Prélever la phase supérieure et si nécessaire recommencer l'étape 4.
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