Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

extraits d'animaux vi rosés permettent de visualiser une troisième bande, en position basse, sur
le gradient de CsCI.
Plusieurs origines peuvent être attribuées à ces différentes bandes. Leur répartition
suggère que la bande majeure (bande haute) représente l'ADN génomique de C. gigas. La
bande en position moyenne, de moindre intensité peut, elle, correspondre à l'ADN satellite ou
mitochondrial de C. gigas (Garber et Yoder, 1983 ; Mc Cutchan et al. 1984). La bande la plus
basse, d'intensité similaire à celle de la bande moyenne, peut être d'origine virale ou provenir
de contaminants tels que des bactéries, qui sont en effet présentes en grand nombre dans les
tissus des animaux vi rosés morts et moribonds utilisés pour ces extractions d'ADN. Toutefois,
rien n'indique que l'ADN viral ne soit pas localisé au niveau des deux autres bandes, en
mélange avec un ADN d'une autre origine, ou même dans une zone du gradient où il est en
concentration trop faible pour être visualisé.
Les différentes bandes d'ADN ont toutefois été prélevées sur ces gradients afin de
comparer leurs profils de migration en gel d'agarose, avant et après digestion par des enzymes
de restriction. Après électrophorèse, les ADN non digérés apparaissent soit sous la forme
d'une bande de haut poids moléculaire (bande haute et bande moyenne), soit sous la forme de
traînées ("smears") reflétant une dégradation importante (bande basse). Après électrophorèse
des ADN provenant de ces trois bandes et digérés par EcoR l ou Kpn l, des traînées d'ADN
sont visualisés sans qu'il soit possible de différencier les lots par l'observation de fragments de
restriction nettement séparés (résultats non montrés).
L'analyse des ADN par digestion enzymatique et électrophorèse n'ayant pas permis
d'attribuer une origine plus précise aux différentes bandes séparées sur les gradients de CsCI,
la possibilité de pouvoir séparer l'ADN viral de l'ADN cellulaire a été abandonnée.
Le clonage de l'ADN total extrait d'animaux vi rosés a été réalisé dans un plasmide
Bluescript KS-. Après digestion partielle par l'enzyme Sau IIIa, les fragments d'ADN ont été
fractionnés en fonction de leur taille, sur un gradient de saccharose 10-40%. Les fragments à
bords francs de taille comprise entre 500 et 4000 pb ont été ligaturés dans un plasmide
Bluescript KS- préalablement linéarisé par l'enzyme Xho 1. Des bactéries DH5a compétentes,
transformées par ce mélange de ligature, ont été sélectionnées sur un milieu additionné
d'ampicilline, X-Gal et IPTG. Les plasmides produits par ces clones bactériens ont été
caractérisés par double digestion enzymatique (Kpn l et Sac 1) et électrophorèse en gel
d'agarose. Environ 250 clones ont été sélectionnés et caractérisés de cette façon. Toutes les
étapes de ce travail sont détaillées en annexe.
La spécificité des fragments clonés a été testée par hybridation sur dot-blot. Des
dilutions 1/10 en série d'ADN extrait d'animaux sains ou virosés ont été déposées à l'aide d'un
manifold, sur une membrane de nylon, de façon à réaliser des spots contenant de lOng à 1 fg
d'ADN (Annexe 2).
Les sondes sont hybridées après marquages à la peroxydase et la révélation est réalisée
à l'aide d'un substrat luminescent (kit ECL, Amersham).
La démarche choisie nécessitant de tester la spécificité d'un grand nombre de
fragments clonés, ceux ci ont été regroupés par lots de cinq fragments de tailles similaires qui
sont testés conjointement. L'hybridation étant réalisée sur des dilution en série (10 ng à 1 fg)
d'ADN extrait d'animaux sains et vi rosés, permet d'obtenir un résultat quantitatif. Dans ce cas,
dans l'hypothèse d'un lot de sondes contenant au moins un fragment spécifique de l'ADN
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