Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

le tampon de transfert et superposée au papier filtre. Le gel est disposé sur la membrane de
nitrocellulose. Neuf feuilles de papier filtre imbibées de tampon de transfert, puis la plaque de
graphite supérieure (cathode) prémouillée à l'eau distillée, sont enfin placées sur le gel.
Une tension de 0,8 mAlcm 2 de gel est appliquée à l'ensemble pendant une heure. Puis,
les feuilles de papier filtre sont éliminées, le gel est coloré à l'argent de façon à contrôler
l'efficacité du transfert et la membrane de nitrocellulose est conservée dans un film SaranVrap
une nuit à 4°C ou plus longtemps à -20°C.
Coloration des protéines à l'argent sur membrane de nitrocellulose
Réactifs
Citrate de sodium
Na) citrate 40%
Sulfate de fer
FeS04-7H20 20%
Nitrate d'argent
AgNO) 20%
Toutes ces solutions sont préparées extemporanément.
Coloration
Laver les membranes de nitrocellulose pendant dix à vingt minutes, par agitation
douce dans de l'eau distillée.
Pendant ce temps, préparer la solution de coloration en mélangeant 27 ml d'eau
distillée avec 1,5 ml de citrate de sodium et 1,2 ml de sulfate de fer. Ajouter à ce mélange 0,3
ml de nitrate d'argent, ce dernier précipite et est redissout en agitant vigoureusement la
solution qui prend alors une couleur brun-vert foncé.
Colorer les membranes dans cette solution pendant cinq à dix minutes, puis rincer par
trois bains de 30 minutes en eau distillée. Les membranes séchées sont conservées dans un
film SaranVrap, à l'abri de la lumière. La coloration s'estompe avec le temps, si nécessaire, les
membranes peuvent alors être recolorées selon le même protocole.
Détection des résidus carbohydrates à l'aide de lectines
Réactifs
Tampon tris
NaCI
Tris Hel
Ajuster le pH à 7,5.
150 mM
50mM
Chloronaphtol
Chloronaphtol 30 à 40 mg
Dissoudre dans 0,2 à 0,5 ml d'éthanol absolu
Ajouter en agitant 100 ml de tampon tris et 10 III d'H20 2 (30%).
Diaminobenzidine
Diaminobenzidine 120 mg
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