Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

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2.1 - Préparation des solutions - Déshydratation, imprégnation et inclusion des échantillons - Confection et contraste des coupes Afin de mieux préserver les ultrastructures, les pièces sont traitées par des solutions d' osmolarité proche de celle des tissus. Ainsi, les tissus d' huîtres sont traités par des solutions d'osmolarité environ 1000 mOsm, et les tissus provenant de poissons par des solutions d' osmolarité comprise entre 400 et 500 mOsm. L'osmolarité de ces solutions est ajustée par addition de solutions de NaCI. Cacodylate de sodium 0,4 M : 8,6 g dans 100 ml d'eau distillée Chlorure de sodium 2% et 10% en eau distillée Tampon cacodylate pH 7,4 : Cacodylate de sodium NaCI Eau distillé Ajuster le pH à 7,4 1000 mOsm 50 ml du stock à 0,4 M 20 ml du stock à 10% 30 ml G1utaraldéhyde 3% : 1000 mOsm G1utaraldéhyde à 25% 2,5 ml Cacodylate de sodium 0,4 M 5 ml NaCI 10% 3,5 ml Eau distillée 9 ml Acide osmique 1 % : 1000 mOsm Acide osmique à 4% 1 vol. Cacodylate de sodium 0,4 M 1 vol. NaCI 1 vol. du stock à 10% Eau distillée 1 vol. EDTA5% Mélange Epon Epon 812 DDSA* MNA* DMP30* 400/500 mOsm 2,14 g 0,565 g 100 ml 400/500 mOsm 2,5 ml 5 ml 12,5 ml 400/500 mOsm 1 vol. 1 vol. 1 vol. du stock à 2% 1 vol. EDT A di sodique 5 g Tampon cacodylate 100 ml Dissoudre par addition de quelques pastilles de soude. L'EDTA se dissout en effet lorsque le pH est supérieur à 8. Lorsque la solution est limpide, ajuster à nouveau le pH à 7,4 par addition d'HCl concentré. 12,32 g 6,2 g 6,2 g 0,3 g 209
• DDSA : Dodecyl succinic anhydre; MNA : Methylnorbornene-2,3-dicarboxylic anhydre ; DMP30 : 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phénol 2.2 - Fixation des tissus Il est très important de fixer convenablement les tissus devant être observés en microscopie électronique, afin de préserver l' ultrastructures aussi bien que possible. Les pièces sont découpées de façon à ne pas excéder 3 à 4 mm de côté. Cette petite taille permet ainsi aux différentes solutions de pénétrer rapidement dans l'échantillon. Si les échantillons ont été préalablement fixés et conservés en Carson, il est nécessaire de rincer par trois ou quatre bains de 24 heures en tampon cacodylate à froid (4°C) avant de fixer à nouveau en glutaraldéhyde 3%. Si les échantillons sont frais, la fixation est réalisée directement en glutaraldéhyde 3% (30 min à température ambiante ou 2 heures et plus à 4°C). Les échantillons sont rincés en tampon cacodylate (trois fois 10 min), post-fixés par l'acide osmique 1% (1 heure à 4°C) et rincés à nouveau en tampon cacodylate (deux fois 10 min). 2.3 - Décalcification des échantillons Les échantillons de larves et de naissains ayant été fixés avec leur coquille, doivent être décalcifiés par l'EDTA, afin de faciliter la préparation ultérieure des coupes. Les échantillons sont déshydratés par des bains successifs d'éthanol (éthanol 70°, une fois 10 min; éthanol 95°, deux fois 15 min; éthanol absolu, trois fois 20 min), puis réhydratés partiellement par un bain de 10 min en tampon cacodylate. Cette déshydratation et réhydratation partielle des échantillons facilite en effet la décalcification ultérieure par l' EDTA. Les échantillons sont décalcifiés par un bain d'EDTA 5%, pendant 15 à 20 heures, l'EDTA est alors éliminé par deux bains de 10 min en tampon cacodylate. 2.4 - Déshydratation, imprégnation et inclusion des échantillons Les échantillons sont déshydratés par des bains successifs d'éthanol: éthanol 70°, une fois 10 min; éthanol 95°, deux fois 15 min; éthanol absolu, trois fois 20 min. La déshydratation est achevée par deux bains de 15 min en oxyde de propylène. Ce solvant également l'imprégnation ultérieure en résine Epon. Les pièces sont imprégnées progressivement. Un premier bain d'une heure est réalisé dans un mélange d'oxyde de propylène-Epon (50-50). Un deuxième bain en Epon seul est alors réalisé. Ce dernier peut avoir une durée variable de une à 20 heures, un bain de longue durée permettant d'obtenir une meilleure imprégnation des tissus. L'inclusion est réalisée en plaçant les échantillons dans des moules remplis de résine Epon. Ces moules peuvent être en forme de cercueils si les pièces sont de grande taille (2 à 3 mm). Si les échantillons sont de petite taille (des larves d'huître ou des échantillons de purification de virus, par exemple), des microtubes de type Eppendorf sont utilisés pour mouler les blocs. Dans ce dernier cas, les échantillons peuvent être concentrés au fond des tubes soit par sédimentation, soit par centrifugation. 210
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