Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

6 - Prélever la phase supérieure et ajouter un volume de chloroforme. Centrifuger
(10 OOOg, 20 min, 4°C).
7 - Répéter l'étape 6.
8 - Précipiter l'ADN contenu dans la phase supérieure en y ajoutant 1/2 volume
d' acétate d'ammonium 7,5M et deux volumes d'éthanol absolu.
S'il s'agit d'une extraction d'ADN à partir d'un échantillon initial relativement petit,
l'ajout de glycogène permet d'améliorer le rendement de précipitation de l' ADN. Dans
ce cas, le glycogène doit être ajouté, puis mélangé avant d'additionner l'alcool.
9 - Placer à -80°C pendant 1 h, puis centrifuger (10 OOOg, 30 min, 4°C) et éliminer le
surnageant.
10 - Rincer le culot par addition d'éthanol 70%, centrifuger (10 OOOg, 2 min, 4°C),
éliminer totalement le surnageant et sécher le culot sous vide (5 min).
11 - Resuspendre le culot dans le tampon désiré ou en TE, stocker à 4°C ou à -20°C.
12 - Si nécessaire, les ARN contaminant la solution peuvent être éliminés par ajout de
SDS (0,1%) et de DNase-free RNase (1 Ilg/ml), incubation Ih à 37°C, extraction et
précipitation selon les étapes 4 à Il .
6.2 - Caractérisation et clonage d'ADN
Diaestion par enzyme de restriction
Les enzymes de restriction sont fournies avec le tampon adéquat, concentré dix fois.
L'ADN est dilué avec de l'eau distillée, un dixième de volume final de tampon de
restriction et les unités d'enzymes requises. La réaction est généralement réalisée par
incubation à 37°C, sauf recommandations particulières pour certaines enzymes.
L'ADN digéré peut alors être directement analysé par électrophorèse en gel d'agarose.
Si l'ADN doit être utilisé dans une réaction de ligature, il est nécessaire de réaliser une
extraction et une précipitation selon les étapes 4 à II du paragraphe 6.1 , puis de
contrôler la qualité et la quantité d'ADN par électrophorèse.
Préparation du plasmide linéaire et liaature
1 - Digérer le plasmide (pBluescript KS-, Stratagene) par l'enzyme de restnctlOn
choisie, puis extraire et précipiter l'ADN selon les étapes 4 à II du paragraphe 6.1.
Contrôler par électrophorèse.
2 - Mélanger 100 ng de plasmide linéaire et 200 ng à 1 Ilg d'ADN devant y être inséré.
3 - Diluer avec les quantités nécessaires d'eau distillée et de tampon de ligature
concentré. Ajouter 10 mM de rATP et deux unités d'enzyme T4 DNA ligase. Le
volume final est d'environ 20 Ill.
4 - Incuber 15-20h à 4°C.
5 - Diluer par addition de 80 III d'eau distillée et utiliser pour la transformation de
bactéries ou conserver congelé à -20°C.
Préparation de bactéries compétentes transfoanation et sélection des clones
Réactifs
RFI
RbCl
MnCI2,4H 20
Acétate de K
CaCI2, 2H 20
100 mM
50 mM
30mM
10mM
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