Contribution à l'étude de virus de mollusques marins apparentés ...

2.1.2 - Extraction, caractérisation et clonage du génome viral à partir de particules
virales purifiées
Des échantillons de particules virales purifiées ayant pu être obtenues à la fin de ce
travail de thèse (Chapitre V), l'extraction et le clonage de l'ADN viral ont été réalisés. La mise
au point d'une méthode de diagnostic de l'infection virale par dot-blot a été initiée.
Les acides nucléiques présents dans les échantillons de virus purifié ont été extraits
selon un protocole classique (Annexe 2). Puis, la nature du génome viral a été déterminée par
digestion par enzymes de restriction et électrophorèse en gel d'agarose (Figure 4).
L'acide nucléique non digéré est de haut poids moléculaire, une seule bande migrant en
amont du marqueur de taille de 21 kpb, peut être observée.
Les profils obtenus après digestion enzymatique par EcoR l ou BgI II permettent de
visualiser plus de 24 bandes de tailles différentes. Ces résultats montrent que le génome viral
peut être coupé par des enzymes de restriction et est donc un acide nucléique de nature ADN
qui, de plus, se présente sous une forme double brin.
La taille du génome viral a été estimée à environ 180 kpb, d'après les profils de
restriction obtenus sur gel d'agarose après digestion totale par EcoR l et BgI II (Figure 5).
Cette estimation est en accord avec les données disponibles pour les virus apparentés aux
Herpesviridae, qui ont des génomes dans une gamme de taille de 120 à 220 kpb. Néanmoins,
la taille du génome viral nécessite d'être précisée, en particulier par une analyse en
électrophorèse en champs pulsé.
De plus, ces résultats confirment les observations réalisées en histochimie. En effet, il
est possible de visualiser, dans le noyau et le cytoplasme des cellules de C. gigas virosées,
l'accumulation de matériel pouvant être coloré par la méthode de Feulgen et Rossenbeck
(Renault el al., 1 994a). Ces inclusions pouvant alors être interprétées comme contenant de
l'ADN (Gabe, 1968). De plus, après coloration à l'acridine orange (Annexe 2), ces inclusions
présentent une fluorescence verte, laissant suspecter la présence d'acides nucléiques double
brin (Gabe, 1968).
L'ADN extrait des particules virales purifiées à partir de larves de C. gigas a été cloné
dans le site EcoR l du plasmide Bluescript KS- (Annexe 2). Environ 300 clones recombinants
ont été obtenus. Quatre de ces clones ont été choisis arbitrairement pour réaliser des essais
d'hybridation en dot blot.
Les inserts des clones pl, p14, p23 et p35, de taille approximative, respectivement:
2500, 2200, 3500 et 1000 pb, ont été purifiés à partir de maxipréparations de plasmides
(Annexe), puis marqués à la peroxydase (kit ECL, Amersham).
Les dot blols comprenaient des dépôts considérés comme témoins positifs (ADN
extrait de particules virales purifiées, plasmide recombinant correspondant à la sonde) ou
comme témoins négatifs (ADN extrait de C. gigas adultes saines). Les autres dépôts ont été
réalisés à partir d'ADN extrait d'un lot de naissain virosé et de quatre lots de larves virosées.
Une série de dilutions au 1/10 a été déposée pour chaque échantillon ainsi que pour les
témoins, dans une gamma allant de 1 Ilg à 0,1 pg.
L'hybridation à 42°C et la révélation ont été réalisées dans les conditions indiquées par
le fournisseur du kit de marquage.
Les résultats montrent une grande spécificité de l'hybridation sur les contrôles positifs
et les échantillons d'ADN extraits des lots d'animaux virosés. Aucune hybridation ne peut être
159