Livro das Actas - advid

2.2-Extração do ADN, construção das bibliotecas de ADN e pirosequenciação
O ADN total de 51 amostras foi extraído usando um protocolo proprietário de extração
de ADN de mostos, e a biblioteca de ADN foi construída para cada amostra individualmente.
Todas as reações de PCR foram realizadas em 30 µL, e cada mistura de reação
continha 2 µL de ADN total, 1.5 unidades de FastStart High Fidelity Taq DNA polymerase
(Roche, USA), 1x tampão de reação com MgCl2 (1.8 mM) incorporado (Roche,
USA), 0.2 mM de dNTPs (Bioron, Germany) e 0.8 µM dos primers para a região V6 e
0.4 µM dos primers para as regiões D2 e ITS2. Para as bactérias, as condições de amplificação
consistiam num passo de desnaturação inicial a 94°C (5min.), seguido de 20
ciclos de desnaturação a 94°C (35s), hibridação a 50°C (35s) e extensão a 72°C (40s) e
por fim um passo de extensão final a 72°C (5min). As condições de amplificação usadas
para os fungos e leveduras foram as mesmas, mas o PCR foi realizado com 25 ciclos.
As amostras foram misturadas de acordo com o número de moléculas de ADN, em concentrações
equimolares e submetidas para pirosequenciação usando a plataforma GS
FLX Titanium (454 Life Sciences, Roche, USA) do Biocant (Cantanhede, Portugal).
2.3-Processamento dos dados da pirosequenciação e análise estatística
As sequências obtidas foram tratadas com uma pipeline de anotação automática implementada
na Unidade de Bioinformática do Biocant. As diferenças da biodiversidade
(Chao1) entre as amostras MI, IF e FF foram avaliadas através de ANOVA usando SPSS
20.0 (IBM, USA). Na comparação da estrutura da comunidade microbiana foi realizada
uma Análise por Componentes Principais (PCA) usando o Bionumerics 6.5 (Applied
Maths NV, Belgium).
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1-Diversidade e riqueza das comunidades microbianas
As fermentações espontâneas analisadas revelaram possuir uma população de microrganismos
bastante mais heterogénea, diversa e rica quando comparada com trabalhos
anteriormente publicados, tendo-se também identificado microrganismos anteriormente
não associados à fermentação de vinhos, em particular um conjunto significativo de
microrganismos não cultiváveis.
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