Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz

damage) + SSBs (single-strand breaks) + DSBs);
- Reagenzien: Wasserstoffperoxid (BD und SSBs), Topoisomerase I Inhibitor Topotecan (SSBs, Spaltungskomplexe)
Enediyene-Antibiotikum Calicheamicin (DSBs, +Apurinic-site), Endonuklease I-SceI (DSBs).
TB 03
3.2 ZELLBIOLOGISCHE/MOLEKULARBIOLOGISCHE/IMMUNOLOGISCHE ANALYSE
- Synchronisationsmethoden: Isoleucinentzug, Doppel-Thymidinblock;
- Knock down/out: siRNA (small interfering ribonucleic acid), Dox (Doxycyclin)-induzierbare shRNA (short
hairpin ribonucleic acid), TALENs® (Transcription Activator-Like Effector Nucleases);
- Zellzyklusprogression: fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS), EdU (5-Ethynyl-2‘-desoxyuridin)-Einbau,
Western Blot, Kinase-Aktivitätsmessung;
- Identifizierung Zellzyklusposition: EdU-Einbau, CENP-F (centromer protein F) Färbung, für die Lebendzellbeobachtung
FUCCI (Fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator)-System, PCNA-GFP (Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen
- green fluorescent protein);
- Expression und Modifikation: Western Blot, phosphorylierungsspezifische Antikörper, Massenspektrometrie;
- Protein-Protein Interaktion: Immunpräzipitation (IP)-Western Blot Analyse;
- Nachweis DNA-Schäden/Brüche: Detektion von H2AX mittels Immunfluoreszenzfärbung (IF) und
Immunhistochemie, alkalischer Comet Assay;
- Evaluierung von Reparaturzentren als Funktion der Zeit: Fluoreszenzmikroskopie, Konfokale Laser Mikroskopie
mit statistischer Auswertung mittels semi-automatischer sowie automatischer (High-Content-zelluläre
Bildgebung) Auszählung von H2AX-, Rad51-, 53BP1-, P-RPA-S33-Foci;
- Rekrutierung von Reparaturfaktoren: Expression von Fluoreszenzprotein-gekoppeltem 53BP1, Mdc1,
Rad52, Ku80;
- Rekrutierung von Replikationsfaktoren: Detektion von Polymerasen mittels IF;
- Replikationsprozesse: EdU- und/oder BrdU-Einbau, DNA Fiber Assay, Replikationssystem mit isolierten
Zellkernen;
- Nachweis von HR (Homologe Rekombination)-spezifischen Reparaturzentren: Charakterisierung generierter
BRCA2 (breast cancer associated) spezifischer Antikörper;
- Bestimmung der HR mittels Plasmid-Rekonstruktionsassay nach transienter und stabiler Transfektion
des Reporterkonstruktes.
4. DURCHFÜHRUNG
4.1 ZELLSYSTEM UND INAKTIVIERUNG ENDOGENER KOMPONENTEN DER ATM/ATR-VER-
MITTELTEN SCHADENSIGNALKASKADEN
Für die Experimente wurde ein isogenes Zellsystem verwendet, bestehend aus der Wildtyp (wtp53) p53 CV-1
Zelllinie (diploide, nicht transformierte Epithelnierenzelle der afrikanischen grünen Meerkatze) sowie der
Doxycyclin (Dox)-induzierbaren wtp53 TO-CV-1-Flag-ATR kd Zelllinie (TO=„tet on“). Die Inhibition der Kinasen
ATM und/oder Chk1 erfolgte durch Zugabe der entsprechenden Inhibitoren KU-55933 und/oder UCN-01. Die
Zellen wurden mittels Isoleucinentzug in der frühen, mittleren und späten S-Phase synchronisiert. Auf Grund
der suboptimalen Transfektionseffizienz der CV-1 Zelllinie wurden die Zelllinien U2OS, HeLa und HT1080 verwendet.
Des Weiteren wurden htert (human telomerase reverse transcriptase)-immortalisierte humane Fibroblasten
mit Gendefekten im ATM- oder Artemis-Gen verwendet [Wildtyp (1BR.3), ATM-defizient (AT1BR), Artemis-defizient
(FO2-385, CJ179)].
4.2 UNTERSUCHUNG DER MITTELS DNA SCHÄDIGUNG AKTIVIERTEN SIGNALKASKADEN
ALS FUNKTION DER ZEIT UND IN RELATION ZUM ZELLZYKLUS
Die Aktivierung von ATM und/oder ATR-vermittelter Signalkaskaden und deren Einfluss auf die Zellzyklusprogression
wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach DNA-Schädigung mittels FACS, Western und IP-Western
Blot sowie IF untersucht.
142 Statusberichte TB 03: Strahlenbiologie - Wirkung von ionisierender Strahlung, Strahlenempfindlichkeit