Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz

4.3 UNTERSUCHUNG DER DNA-REPARATUR- UND REPLIKATIONSPROZESSE NACH DNA-
SCHÄDIGUNG REPLIZIERENDER S-PHASE ZELLEN
DSBs (H2AX-Foci) und HR (Rad51-Foci) wurden mittels IF als Funktion der Position im Zellzyklus untersucht
und Strangbrüche zusätzlich mit dem alkalischen Comet Assay erfasst. Die Replikationsaktivität wurde durch
EdU-Einbau visualisiert und die replikativen Initiationsereignisse sowie Elongationsprozesse mit dem DNA-Fiber
Assay analysiert. Zusätzlich wurde für die Analyse der Replikationinitiationsaktivität die Chromatinbindung,
der Phosphorylierungsstatus und das Interaktionsmuster von entsprechenden Replikationsfaktoren untersucht.
4.4 IDENTIFIZIERUNG DER ZELLZYKLUSPHASE BEI LEBENDZELLBEOBACHTUNG
Das FUCCI-System ermöglicht bei Lebendzellbeobachtung die Zuordnung der Zellen zu den Zyklusphasen
G1 (Expression von Cdt1-mKO2, orange) und S/G2 (Expression von Geminin-mAG, grün); in der frühen
S-Phase sind kurzeitig beide Proteine exprimiert.
5. ERGEBNISSE
Das vierte Minisymposium fand am Heinrich-Pette-Institut in Hamburg und das fünfte an der LMU München
sowie gemäß fachlicher Auflage im Bundesamt für Strahlenschutz (Dienststelle Neuherberg) unter Mitwirkung
aller Beteiligten des Vorhabens statt. Im Mittelpunkt dieser Zusammenkünfte standen die Präsentation der erzielten
Ergebnisse sowie deren Diskussion.
TB 03
5.1 ATM/ATR-SIGNALKASKADEN IN DER S-PHASE (AG DORNREITER)
Die Aktivierung der ATM Signalkaskade erfolgt unabhängig von der S-Phasen Position zum Zeitpunkt der Bestrahlung
(2 Gy), während die ATR/Chk1-vermittelte Schadensantwort nur in bestrahlten früh- und mitte-S
Zellen zu beobachten ist. Zusätzlich zeigte sich, dass die Aktivierung der ATM und ATR Signalkaskaden sequenziell
und unabhängig voneinander erfolgt, diese sich aber in Hinblick auf die Signalintensität und -dauer
gegenseitig beeinflussen. Untersuchungen zur S-Phasen Funktion von ATM zeigten, dass ATM insbesondere
für bestrahlte früh-S Zellen in Hinblick auf die Reparatur- und Replikationsvorgänge essenziell ist. Bezüglich
der Reparaturvorgänge wurde beobachtet, dass die ATM-Inaktivierung in den früh-S bestrahlten Zellen zur
Persistenz von Rad51-Foci und DNA-Strangbrüchen führt, während in mitte- oder spät-S bestrahlten Zellen
die Rad51-Foci nicht persistieren bzw. erst gar nicht entstehen. Diese Befunde zeigen, dass in ATM inhibierten
Zellen die Rad51 Problematik eng an die Aktivierung der ATR/Chk1 Signalkaskade und somit an die Position
der Zelle in der S-Phase bzw. an den fortschreitenden Replikationsprozess gekoppelt ist. Ein Grund für
die beobachtete Problematik der Rad51 involvierenden Reparatur von sekundären DSBs in G1/S bestrahlten
Zellen könnte sich durch die fehlende Ausbildung von BRCA2-Foci erklären, deren Entstehung strikt ATM abhängig
ist. Naheliegend ist, dass im ATR/Chk1-vermittelten intra-S Kontrollpunkt BRCA2 für das Be- und Entladen
von Rad51 und somit für den HR-gesteuerten Reparaturprozess replizierender Zellen essenziell ist.
Des Weiteren fällt auf, dass unter ATM-Inhibition nur bestrahlte früh-S Zellen ein langanhaltendes, starkes
Chk1-Phosphorylierungssignal aufweisen, welches in mittig und spät replizierenden Zellen nicht beobachtet
wurde. In ATM-inhibierten bestrahlten früh-S Zellen korrelierte die langanhaltende Chk1-Aktivierung mit einem
stetigen Anstieg der „Origin“-abhängigen Initiationsfrequenz bei gleichzeitiger Erniedrigung der Elongations-/Replikationsrate.
Anzunehmen ist, dass auf Grund der auftretenden Elongationsprobleme Chk1 zur Aktivierung
von sogenannten „dormant origins“ führt, die einem Replikationsstopp in den bereits etablierten Replikationszentren
entgegenwirken könnte. Unterstützt wird diese Annahme durch den „SNAKE“ Befund: In
ATM-inhibierten Zellen wird „Origin“-kompetente Polymerase in die mittels Microbeam generierten und mit
H2AX-markierten „Tracks“ geladen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass in ATM-inhibierten Zellen
die schadeninduzierte Rekrutierung dieser Polymerase Subpopulation Chk1 abhängig ist.
5.2 EINFLUSS VON RAD51- UND PALB2-EXPRESSION AUF DIE REPLIKATION (AG BORG-
MANN)
Die Expression von RAD51 zeigt eine breite Variation in Tumoren. Gezeigt werden konnte, dass die RAD51-
Überexpression als ein unabhängiger, negativer prognostischer Marker im kolorektalen Adenokarzinom eingestuft
werden kann. Die negative Prognose zeigte sich auch nach alleiniger Strahlentherapie, insbesondere
aber in metastasierten Tumoren. Es wurde überprüft, ob die Ursache hierfür auf eine erhöhte genomische Instabilität
mit einer daraus resultierenden höheren Malignität oder generell auf eine erhöhte Resistenz nach
DNA-Schädigung in der S-Phase zurückzuführen ist. In einem Modellsystem zeigte sich, dass die
Statusberichte TB 03: Strahlenbiologie - Wirkung von ionisierender Strahlung, Strahlenempfindlichkeit 143