Programmreport 2012 - DORIS - Bundesamt für Strahlenschutz

RAD51-Überexpression auf eine erhöhte genomische Instabilität zurückzuführen ist. Die RAD51-Überexpression
führte zu einer Verlangsamung der Replikationsprozesse und zu einer vermehrten Aktivierung von Replikationsursprüngen.
Diese vermehrte „Origin“-Aktivierung ist auf eine verminderte Auslösung des Intra-S-Arrests
zurückzuführen, betont durch eine verminderte Chk1-Aktivierung, und wurde nach Bestrahlung und Induktion
der singulären Schäden beobachtet. Darüber hinaus zeigten Zellen mit einer hohen RAD51-Expression,
eine verringerte HR-Kapazität im Plasmid-Rekonstruktionsassay. Diese verminderte Rekombinationsfähigkeit
äußerte sich auch in einer erhöhten Empfindlichkeit nach Behandlung mit in der S-Phase schädigenden
Agenzien. Die Beobachtungen im Modellsystem konnten in Tumorzelllinien mit endogenem unterschiedlich
exprimierten RAD51 verifiziert werden. Zelllinien mit einer mittleren RAD51-Expression erwiesen sich als
effektiv in allen untersuchten Assays, während eine geringe oder hohe Expression sich deutlich auf die Replikationsprozesse,
HR-Kapazität und zelluläre Empfindlichkeit auswirkten. Die Befunde zeigen, dass nur
eine ausbalancierte Expression von Reparaturproteinen eine fehlerfreie Reparatur gewährleistet. Dieser Befund
trifft auch für Trägerinnen einer heterozygoten PALB2-Mutation zu. Die auf Grund der Haplosuffizienz
beobachtete Reduktion der PALB2-Expression äußerte sich in deutlichen Effekten auf die Replikationsprozesse
und Intra-S-Signaltransduktion. Die Arbeit liegt zurzeit bei Nature Communications zur zweiten Begutachtung
vor.
TB 03
5.3 LEBENDZELLBEOBACHTUNG IN DER S-PHASE (AG FRIEDL)
Verschiedene Methoden zur Synchronisierung von gut transfizierbaren Zelllinien wie HeLa, U2OS und
HT1080 wurden getestet und optimiert. Es zeigte sich, dass sich auch nach Optimierung höchstens 70% der
Zellen in der gewünschten Phase befinden. Dies ist für die weiteren Analysen auf Einzelzellniveau nicht ausreichend.
Daher wurde auf die Etablierung und Nutzung von zellzyklusspezifischen Lebendzellmarkern umgeschwenkt.
Verschiedene Linien, die Marker für G1 (Cdt1), S/G2 (Geminin) oder G2 (Cyclin B) exprimieren,
sind inzwischen vorhanden, z. T. auch in Kombination mit fluoreszenz-markierten DSB-Response-Faktoren
(s. u.). Analysen des Wachstumsverhaltens und der Schadensantwort in diesen Linien werden gegenwärtig
komplettiert. Als spezifischer S-Phase-Marker, der auch die Unterscheidung von früher und später S-Phase
ermöglichen sollte, sollte PCNA-GFP genutzt werden. Es stellte sich jedoch heraus, dass sich durch die
PCNA-Überexpression artifizielle Komplexe bilden können, die nicht von dem typischen Signal in der späten
S-Phase unterscheidbar sind, so dass die Phasenzuordnung nicht eindeutig ist. Gegenwärtig wird getestet,
ob sich durch PCNA-Chromobodies das Problem lösen lässt. Des Weiteren konnte eine LET-Abhängigkeit
der Rekrutierung von Mdc1, aber nicht von 53BP1 gezeigt werden. Als fluoreszenz-markierter Schadensmarker
liegt inzwischen neben 53BP1 und Mdc1 auch Rad52 (als Marker für homologe Rekombination) vor. Vorversuche
zur Eignung von Ku80-GFP oder XRCC4 als focibildender Marker für NHEJ-Reparatur zeigten, dass
diese Proteine unter den Bedingungen ionisierender Bestrahlung im Gegensatz zur Laserbestrahlung keine
detektierbaren Foci bilden (Kooperation W. Dirks und C. Mielke). Gegenwärtig wird ein experimentelles System
entwickelt, das nach gezielter Protonenbestrahlung in geometrischen Mustern eine Unterscheidung von
a) direkt strahleninduzierten DSB, b) sekundären DSB, die sich während der S-Phase aus anderen strahleninduzierten
DNA-Schäden entwickeln, und c) replikationsbedingten DSB, die unabhängig von der Strahlenwirkung
auftreten, ermöglichen soll. Des Weiteren wird untersucht, ob in der sogenannten H2AX-Domäne
aktive Replikation stattfindet. Erste Ergebnisse deuten auf eine Anti-Korrelation von H2AX und aktiver Replikation
hin.
5.4 STRAHLENWIRKUNGEN BEI DER REPLIKATIONSINITIATION (AG GROßE/POSPIECH)
Es wurden Fragmente des menschlichen BRCA2 in Escherichia coli rekombinant exprimiert und für die Immunisierung
von Kaninchen und Mäusen verwendet. Es konnten jeweils acht polyklonale und monoklonale
Antikörper (Ak) gegen drei Regionen des menschlichen BRCA2-Proteins produziert werden. Zwei monoklonale
Ak zeigen hohe Spezifität im Western Blot, ein polyklonaler Ak eignet sich für die IF. Die Antikörper erkennen
neben humanen BRCA2 auch BRCA2 aus CV-1-Affenzellen. Die Antikörper stehen allen Teilprojekten
zur Verfügung und wurden bereits erfolgreich eingesetzt. Die Analyse der direkten Auswirkungen einer
ionisierenden Bestrahlung auf die Replikationinitiationsaktivität in Hinsicht auf Chromatinbindung, Regulation
durch Phosphorylierung und Interaktionsmuster ist in vollem Gange. Die Arbeiten konzentrierten sich vor allem
auf Cdc45, da dieses Protein als limitierender Faktor der Replikationsinitiation auch als Ziel der Schadensantwort
hohe regulatorische Bedeutung hat. Das Cdc45-Phosphorylierungsprofil vor und nach Bestrahlung
wurde durch massenspektrometrische Analyse bestimmt. Die Relevanz einzelner, neu identifizierter
Phosphorylierungsstellen wird gegenwärtig durch phospho-mimetische und phosphorylierungsresistente
Aminosäureaustausche für die strahleninduzierte Schadensantwort untersucht. Cdc45 induzierbare CV-1-
und HeLa-Zelllinien wurden charakterisiert. Die Überexpression von Cdc45 führt zum „Feuern“ vieler neuer
„Origins“, zur verlangsamten Elongation der neu gestarteten Replikationsgabeln, einer starken Zunahme vor-
144 Statusberichte TB 03: Strahlenbiologie - Wirkung von ionisierender Strahlung, Strahlenempfindlichkeit