Doktorarbeit Endversion - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

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Anreicherung:
• Stomachern bei 230 rpm, 2 min (bei Volumen unter 100 ml zusammen mit einem
2. Beutel als Volumenausgleich 100 ml), (Mikrobiologie, Stomacher 400
Circulator)
• Überstand auf 1 oder 2 Zentrifugenröhrchen (volumenabhängig) verteilen
• Bei 200g für 5 min zentrifugieren
• Überstand in neues Zentrifugenröhrchen überführen, Pellet verwerfen
• bei 60°C für 1 h inkubieren
• bei 1500g für 30 min bei RT zentrifugieren
• pro Probe ein RCM+-Röhrchen und zusätzlich 1 oder mehrere zum
Resuspendieren der Pellets für 10 – 15 min im Dampftopf bei 100 °C für 10 -15
min entgasen
• Entgaste Röhrchen auf mind. 40°C abkühlen Bechergl as mit Wasser)
• Überstand der zentrifugierten Proben verwerfen
• Feste Pellets mit einer Transferpipette möglichst luftblasenfrei mit 1ml oder mehr
RCM+ aus Extra-Röhrchen resuspendieren, weiche Pellets ohne RCM+ mischen
• Ca 1ml des Ursprungpellets in das RCM+–Röhrchen überführen und möglichst
luftblasenfrei mischen
• Für 5d bei 37 o C anaerob bebrüten
• Restpellets bei -20°C einfrieren
Weiteres Vorgehen:
Beim Abnehmen der Proben Gasbildung beurteilen
Nach ca. 5 Tagen
1. Bouillon vorsichtig mischen, 1ml abnehmen und bei 7500 rpm (5000g) für 10 min
in der Eppendorfzentrifuge abzentrifugieren, den Überstand verwerfen und die
DNA entweder gleich mit dem Qiagen-Stool-Kit isolieren oder das Pellet bei -20 o C
einfrieren
2. je 2 x 1 ml in sterile Schraubröhrchen füllen und bei -80°C aufbewahren
3. bei Futtermittel 1 ml Bouillon in ein neues entgastes RCM+-Röhrchen überführen
und luftblasenfrei mischen
4. für ca. 5 weitere Tage bei 37°C inkubieren