Doktorarbeit Endversion - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

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9.4). Darüber hinaus wurden bei PCR-Untersuchungen auf toxinbildende Gene von
Clostridium botulinum Typ A bis F durch das Institut für Lebensmittelqualität und –
sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover keine Hinweise auf eine
entsprechende Clostridienbelastung festgestellt (s. Tab. 9.3).
5.3 Verwendete Parameter und kritische Betrachtung
Die verwendeten Parameter (pH-Wert, Ammoniakkonzentration, Bildung flüchtiger
Fettsäuren, bakterieller Proteingehalt, Überstandsmenge, Gasproduktion und –zusammensetzung)
bieten eine umfassende Charakterisierung der Fermentationsvorgänge
des Pansens, die im RuSiTec messbar sind. Durch ihre mehrfache Erprobung
in vorangegangenen Arbeiten und ihre Präzision (VK < 5 %, s. Tab. 3.2)
eignen sie sich zur Untersuchung der Arbeitshypothese.
5.4 Bewertung der ergänzenden Methode (Vitalfärbung der
Protozoen)
Die Beeinflussung der Protozoenvitalität durch Clostridiengaben oder die Kombination
aus Clostridien- und Silagengaben sollte mittels Vitalfärbung ergründet werden.
Verschiedene Farbstoffe wurden auf ihre Eignung geprüft (s. Tab. 3.7), die
sowohl als solche, als auch in Form von zuvor gefärbter Hefe oder Stärke den Proben
zugesetzt wurden. Hierbei eignete sich Hefe besser als Stärke, da letztere sich
nicht so intensiv färbte. Durch den Einsatz der gefärbten Hefe, welche durch die
Protozoen inkorporiert wurde, konnte die Vitalität der Protozoengattungen Entodinium
und Diplodinium lichtmikroskopisch beurteilt werden. Bei anderen Einzellern
war keine Hefeaufnahme zu beobachten (vergl. Kap. 3.8). Mit Kongorot gefärbte
Hefe in einer Konzentration von 1,2 % in der Endlösung eignete sich am besten zur
Vitalfärbung der Protozoen und ähnelte im Gegensatz zu blauen und grünen
Farbstoffen nicht den Futterpartikeln. Die Ergebnisse der Hefeaufnahme bestätigten
sich in acht unabhängig voneinander durchgeführten Wiederholungen. Durch die
Negativkontrolle bei jeder Wiederholung wurde gesichert, dass die Aufnahme nur
durch lebende Protozoen erfolgte.
Die Temperatur der Probe musste während des Versuchs bei 39 °C liegen, da diese
der Temperatur im Pansen, bzw. RuSiTec entspricht. Der Verschluss der Reagenzgläser
minimierte die Sauerstoffzufuhr.
Das Auszählen von 100 Protozoen pro Probe ermöglichte eine Beurteilung der
Hefeaufnahme. Um eine ausreichende Menge Protozoen in der Probe zu erhalten,
die lichtmikroskopisch beurteilt wurde, war eine vorherige Zentrifugation über zehn
Min. mit 28.000 xg bei RT ausreichend, um die Protozoen im Bodensatz von der restlichen
Probe abzutrennen. Bei einer 200fachen Vergrößerung war die Differenzierung
der Protozoen möglich.