Doktorarbeit Endversion - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

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3.8.2 Färbemethoden zur Differenzierung von Clostridien in
Protozoen
Um herauszufinden, ob Protozoen Clostridien inkorporieren, wurden weitere Färbeversuche
durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Bodensätze der Proben aus
der Proteinbestimmung nach dem ersten Zentrifugationsschritt verwendet. Mit einer
Öse wurden sie auf einem Objektträger ausgestrichen und nach Trocknen und
Hitzefixierung nach Gram gefärbt. Durch verschiedene Versuchsansätze sollte die
Menge an Protozoen und gleichzeitig die Sauberkeit der Proben verbessert werden
(s. Tab. 9.8).
Ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt mit 30 %-iger Saccharoselösung sollte die
Menge an Protozoen im Bodensatz steigern, da diese osmophil sind. Während der
Waschschritte mit 0,9 %-iger NaCl sollte der Anteil an freien Bakterien und
Dreckpartikeln verringert werden.
Die unterschiedliche Behandlung brachte keinerlei Verbesserung in der Protozoenausbeute.
Auch die Menge an Schmutz- und Futterpartikeln konnte durch Wasch-
und Zentrifugationsschritte nicht vermindert werden.
3.8.2.1 Gram-Färbung
In den Läufen 3 und 4 wurden Ausstriche von Pansensaftproben angefertigt und
nach Gram gefärbt. In Kapitel 3.8.2 wurde beschrieben, wie die Proben aufbereitet
wurden. Nach der Bearbeitung wurde ein Tropfen mit einer Öse ausgestrichen. Nach
der Hitzefixierung folgte eine dreiminütige Färbezeit in Gentianaviolett. Anschließend
wurde der Objektträger zwei Min. in Lugolsche Lösung getaucht, drei Min. lang in
Alkohol geschwenkt und zum Schluss 15 Sekunden mit Fuchsin überfärbt. Nachdem
das Präparat mit Aqua bidest. abgespült und luftgetrocknet wurde, war eine Beurteilung
des Ausstrichs möglich.
Eine Vielzahl der Protozoen konnte nicht beurteilt werden, da sie komplett
dunkelviolett angefärbt wurden und somit keine Differenzierung der Bakterien in
ihrem Inneren möglich war. Bei anderen Protozoen konnte man deutlich sehen, dass
sich Bakterien auf der Oberfläche und im Inneren der Einzeller befanden. Hierbei
färbten sich lediglich die grampositiven Bakterien dunkelviolett, das Innere der
Protozoen hingegen rosa. Eine Differenzierung der Arten war aber lichtmikroskopisch
nicht möglich.
Nach dem Ausstreichen von Proben aus den Fermentern, denen Clostridien zugefügt
wurden, waren vereinzelt Stäbchen zu finden, bei denen es sich aufgrund ihres
Aussehens um Clostridien handeln könnte. Das heißt, dass eine Zentrifugation mit
200 xg für zehn Min. (Hettich Universal) auch die Bakterien im Medium zumindest
teilweise ins Pellet beförderte. Viele Stäbchen waren allerdings nicht aufzufinden,