Doktorarbeit Endversion - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
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DNA-Isolierung für gram-positive Bakterien aus Kot-Anreicherungen (QIAmp<br />
DNA Stool-Methode)<br />
1. Falls Puffer ausfällt: ASL und AL vor Arbeitsbeginn bei bis zu 70°C erwärmen.<br />
2. Thermoblock für 2 ml Reaktionsgefäße auf 95°C vo rheizen<br />
1. 1 ml Bakteriensuspension in einem 2 ml Original Eppi überführen<br />
2. bei 7500 rpm für 10 min zentrifugieren<br />
3. Überstand verwerfen<br />
oder eingefrorenes Bakterienpellet einsetzen (2 ml Reaktionsgefäß, es sollte<br />
nur kurz auftauen)<br />
4. mit der Pipette das Pellet in 1,4 ml ASL-Puffer resuspendieren<br />
5. vortexen bis die Probe homogenisiert ist<br />
6. mind. für 10 min bei 95°C inkubieren (im Schüttl er)<br />
7. vortexen, 1 min bei 14000 rpm zentrifugieren und Thermoblock auf 70°C stellen<br />
8. 1,2 ml Überstand in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführen, Pellet verwerfen<br />
9. 1 Tablette InhibitEX zugeben und mind. 1 min oder bis zum vollständigen Lösen<br />
der Tablette vortexen<br />
10. 1min oder etwas länger bei RT inkubieren<br />
11. 3 min bei 14000 rpm zentrifugieren<br />
12. Überstand in ein neues 2ml Reaktionsgefäß überführen und Pellet verwerfen<br />
13. 3 min bei 14000 rpm zentrifugieren<br />
14. 15 µl Proteinase K in ein 2 ml Reaktionsgefäß vorlegen<br />
15. 200 µl Überstand aus Schritt 12 zur Proteinase pipettieren<br />
16. 200 µl AL-Puffer zugeben und vortexen<br />
17. 10 min bei 70°C lysieren<br />
18. 200 µl Ethanol (96-100%) zugeben<br />
19. Vortexen<br />
20. auf DNeasy ® Mini spin (Minisäule) mit 2 ml Reaktionsgefäß pipettieren<br />
21. 1 min bei 8000 rpm zentrifugieren<br />
22. Minisäule auf neues 2 ml Reaktionsgefäß setzen<br />
23. 500 µl AW1-Puffer auf Minisäule pipettieren<br />
24. 1 min bei 8000 rpm zentrifugieren<br />
25. Minisäule auf neues 2 ml Reaktionsgefäß setzen<br />
26. 500 µl AW2-Puffer auf Minisäule pipettieren<br />
27. 3 min bei 14000 rpm zentrifugieren<br />
28. Minisäule auf neues1,5 ml Reaktionsgefäß (nicht mitgeliefert) setzen<br />
29. 100 – 200 µl AE-Puffer auf Minisäule pipettieren<br />
30. 1 min bei Raumtemperatur inkubieren<br />
31. 1 min bei 8000 rpm zentrifugieren<br />
32. Eluat weiter untersuchen, Minisäulen verwerfen.
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