Doktorarbeit Endversion - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

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Wesentlichen stimmten die Ergebnisse der drei Farbstoffe überein: über 80 % der
Protozoen nahmen so große Hefe- und Stärkemengen auf, so dass ihr Inneres
komplett ausgefüllt war (s. Abb. 3.2).
Die Beurteilung des Farbstoffs Methylenblau nach Löffler gestaltete sich bei jedem
Zusatz schwieriger als bei Kongorot, da die blaue Färbung leichter mit der gräulichgrünen
Färbung aufgenommener pflanzlicher Partikel verwechselt werden konnte.
Janusgrün stellte sich als unsicherer Farbstoff dar. Bei zwei verschiedenen Ansätzen
von angefärbter Hefe und Stärke färbte sich der Farbstoff während des Erhitzens lila.
Eine Differenzierung des Farbstoffs im Inneren der Protozoen war leicht möglich. Bei
einem dritten Ansatz hingegen behielt Janusgrün seine grüne Farbe und erschwerte
somit die Differenzierung durch die Farbgleichheit mit Pflanzenpartikeln.
Der Einsatz von gefärbter Stärke brachte zwar bessere Farbeffekte, aber auch
ungefärbte Stärke konnte in den Protozoen ohne Schwierigkeiten identifiziert werden.
Ein weiterer Unterschied zur Hefe war die Partikelgröße. Die Stärkekörner waren
etwa viermal so groß wie die Hefepartikel. Ein Einfluss dieses Größenunterschieds
auf die Aufnahme durch die Protozoen konnte allerdings in den vorliegenden
Versuchen nicht festgestellt werden.
Diese Versuche wurden mit frisch aus dem Spendertier entnommenen Pansensaft
durchgeführt. Das Verhältnis der verschiedenen Protozoenspezies stimmte daher
nicht mit dem einer aus dem RuSiTec entnommenen Probe überein.
3.8.1.3 Austestung der Vitalfärbung im RuSiTec
In insgesamt vier Läufen wurden mit Hefe versetztes Methylenblau nach Löffler (n=1)
und Kongorot (n=3) zur Vitalfärbung der Protozoen aus dem RuSiTec eingesetzt.
In den Läufen fünf und sechs erfolgten die Färbeversuche von Tag 9 bis Tag 28
während der verschiedenen Phasen des RuSiTec (s. Tab. 3.1)
In den Läufen sieben und acht begannen die Färbeversuche mit Kongorot ab Tag
vier (Einlaufphase) und wurden bis zum Versuchsende durchgeführt.
Wie in den Vorversuchen wurde jeweils eine Menge von fünf mL Fermenterflüssigkeit
morgens vor der Beladung des RuSiTec entnommen und Farbstoff in vorgewärmte
Reagenzgläser gefüllt, so dass in den fünf mL Probenvolumen 0,8 % Farbstoffkonzentration
erreicht wurde. Nach zwei Stunden Inkubation bei 39 °C folgte die Zentrifugation
der Fermenterflüssigkeit mit 28.000 xg für fünf Min. bei RT und die
Verwerfung des Überstands. Der Bodensatz wurde in 0,4 mL 0,9 %-iger NaCl gelöst.
20 µL dieser Lösung wurden auf einen Objektträger gegeben und mit einem Deckgläschen
abgedeckt. Eine Auszählung von 100 Zellen diente zur Beurteilung der
Farbstoffaufnahme.