Doktorarbeit Endversion - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

- 133 -
Cl. botulinum-Diagnostik mittels PCR
aktueller Stand: 4.5.10 (überarbeitet 12/10)
Nachweis von BoNT C1
(Franci-Primer):
Primer der 1. PCR: Franci I/II 614 bp
Franciosa, et.al., J. of. Clin. Microb. Apr. 1996, p. 882.885
Primer der 2. PCR: Franci III/II 537 bp
reverse-Primer identisch mit dem der 1. PCR
forward-Primer von U. Peters
Zur Kontrolle kann das Produkt durch Hinf I geschnitten werden (für 2. PCR
entstehen 2 Produkte mit 374/377 und 385/388 bp Größe
Nachweis von BoNT C2:
Primer der 1. PCR: pC2-F2/R2, U. Peters 466 bp
Primer der 2. PCR: pC2-F3/R3 U. Peters 211 bp
Primer aus Sequenz AB 465554 (Plasmid pC2C468)
DNAX:
Primer der 1. PCR: DNAX-CD-F/DNAX-R5 U. Peters 432 bp
Primer der 2. PCR: DNAX-(CD-F/R) U. Peters 191 bp
Die Primer sind leider nicht für Cl. bot C+D spez., da sich alle Clostridien-Sequenzen
sehr ähneln. Je nachdem wie die PCR läuft, entstehen auch mit anderen Clostridien
PCR-Produkte der richtigen Größe.
Ich bin zur Zeit auf der Suche nach einem Enzym, dass nur Cl. bot. Typ C+D
schneidet. Das letzte Enzym hat zwar unsere Kontrolle (CCUG 7970) geschnitten,
aber alle Anreicherungen hatten in der Erkennungssequenz eine Mutation und
wurden nicht geschnitten. Ansonsten schneiden die meisten gängigen Enzyme auch
DNAX-Produkte der anderen Clostridenstämme. # MboI 160bp +33bp = Spezifität ?
Cpa (Toxingen für alle Cl. perfringens-Typen)
Cpa cpa F/R 400 bp
Primer : Heikinheimo et al., The Society for Applied Microbiology, 2005
Auswertung der PCR-Produkte:
DNAX + BoNT C1 + C2 positiv = Cl. Bot Typ C nachgewiesen