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Técnico Superior Sanitario de Laboratorio de Diagnóstico Clínico
- Tapar los tubos y mezclar bien invirtiéndolos varias veces, e introducirlos en estufa de 37º C
colocándolos ligeramente inclinados sobre una pipeta, con la cara plana del tubo hacia abajo
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c) Cultivo
Incubar a 37º c durante 48 horas. Agitar y homogeneizar bien todos los días al principio y al final de la
mañana.
d) Bloque en fase de síntesis (sincronización)
Al final de la mañana del segundo DIA de cultivo añadir la timidina “alta concentración”. La timidina
frena la división celular en fase de síntesis. Homogeneizar bien y continuar la incubación 17 horas más.
e) Desbloqueo
- Homogeneizar, centrifugar y eliminar el medio de cultivo. (Los tubos Leightonn se deben colocar en la
centrifuga con la cara plana hacia fuera)
- Añadir el medio de lavado, homogeneizar y volver a centrifugar.
- Eliminar el sobrenadante y añadir el medio de cultivo reconstituido e incubar durante 4 horas en baño
maría a 37º C.
f) Parada en metafase
Pasadas las cuatro horas añadir la colchicina, (que bloqueara la división celular en la fase de metafase)
y homogeneizar
g) Choque hipotónico
- Durante la incubación, prepararemos los tubos necesarios con la solución hipotónica (CLK) y los
introduciremos e el baño maría.
- Centrifugar los cultivos durante 7 minutos.
- Eliminar el medio de cultivo y agitar con cuidado pero insistentemente el botón celular.
- Con pipeta pasteur añadir 2ml de solución hipotónica precalentada a 37º C homogeneizando bien.
- Completar con el resto de cloruro potásico, homogeneizar y dejar actuar durante 2 minutos
h) Fijación
- Centrifugar durante 7 minutos
- Eliminar el sobrenadante y agitar con cuidado pero insistentemente el botón celular.
- Añadir la solución de fijador (metanol/acético 3 a1) poco a poco pipeteando hasta unos 6 ml. (Verificar
que no tiene grumos).
- Dejar actuar durante 10 minutos.
- Centrifugar y eliminar el sobrenadante.
- Repetir esta operación tres veces.
- Agitar el botón celular y añadir unos 6ml de fijador. Guardar en la nevera.