laboratorio de genética: genética hereditaria - Mediante este portal ...

- Extraer unos 5ml de sangre periférica en un tubo de heparina- sodio estéril
b) Siembra
- En recién nacidos y en sangre de cordón hacer frotis para ver el % de eritroblastos
Laboratorio de Genética: Genética Hereditaria
- Centrifuga la sangre a 600 rpm durante 10 minutos (en caso de que no se aprecie bien la capa de
leucocitos volver a centrifugar a 1500 rpm durante 10 minutos)
- Desechar el plasma y recoger la primera capa de leucocitos y hematíes y añadirlo al medio de cultivo.
Homogeneizar y hacer contaje en contador hematológico. (En el recuento es conveniente que la hemoglobina
este entre 2-4 gr/dl).
- Sembrar alrededor de 2x106 de linfocitos en tubo Leighton en medio de cultivo reconstituido
- Añadir Phitohemaglutinina (PHA).- Mitógeno que estimula la división de los linfocitos adhiriéndose a la
pared celular- dependiendo de la cantidad de hemoglobina y del porcentaje de linfocitos totales.
- Tapar los tubos y mezclar bien invirtiéndolos varias veces, e introducirlos en estufa de 37º C
colocándolos ligeramente inclinados sobre una pipeta, con la cara plana del tubo hacia abajo
c) Cultivo
Incubar a 37º C. Agitar y homogeneizar bien todos los días al principio y al final de la mañana.
d) Sincronización
Al final del segundo día de cultivo, añadir la solución de trabajo de MTX, a cada tubo de cultivo.
Envolver los tubos en papel de aluminio e incubar hasta el día siguiente a 37º C.
A la mañana siguiente lavar dos veces y añadir la Timidina (a bajas dosis) a cada tubo incubar a 37º C
durante 4 a 7 horas
Pasado este tiempo añadir la colchicina y dejar actuar 30 minutos
e) Choque hipotónico
- Durante la incubación, prepararemos los tubos necesarios con la solución hipotónica (CLK) y los
introduciremos e el baño maría.
- Centrifugar los cultivos durante 7 minutos.
- Eliminar el medio de cultivo y agitar con cuidado pero insistentemente el botón celular.
- Con pipeta pasteur añadir 2ml de solución hipotónica precalentada a 37º C homogeneizando bien.
- Completar con el resto de cloruro potásico, homogeneizar y dejar actuar durante 2 minutos
f) Fijación
- Centrifugar durante 7 minutos
- Eliminar el sobrenadante y agitar con cuidado pero insistentemente el botón celular.
- Añadir la solución de fijador (metanol/acético 3 a1) poco a poco pipeteando hasta unos 6 ml. (Verificar
que no tiene grumos).
- Dejar actuar durante 10 minutos.
281